京尼平對(duì)高糖氧化損傷的H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用

師 巖 陳慶友 劉玉寶 寧小美 張春晶 王小龍 李 林 徐 晶 張雪麗

ProtectiveEffectofGenipinonH9c2CellsagainstHighGlucose-inducedInjuryofOxidativeStress.ShiYan,ChenQingyou,LiuYubao,etal.DepartmentofBiochemistry,QiqiharMedicalCollege,Heilongjiang161006,China

AbstractObjectiveTo explore attenuate effects of genipin on high glucose-induced oxidative injury in H9c2 cells.MethodsH9c2 cells were cultured in vitro and divided into four groups. We measured viability of H9c2 exposed to different concentrations of glucose by CCK-8 assay. The oxidative stress-induced early apoptosis of cells were analyzed by AnnexinⅤ/PI flow cytometry. The levels of CK-MB in the supernatant of culture media and the levels of MDA and SOD in the H9c2 cells were determined by colorimetry.ResultsCCK-8 assay results showed that the viability decreased with the 33.3 mmol/L glucose concentration, while the group pretreated with 10μmol/L genipin could increase the viability significantly (P<0.05). Compared with the control group, high glucose could induce cell oxidative stress-induced early apoptosis by AnnexinⅤ/PI flow cytometry, while genipin could inhibit the early apoptosis induced by high glucose significantly(P<0.05). The results showed significant increase of CK-MB and MDA levels and decrease of SOD activity in the high glucose group compared with the control group. However, the high glucose group pretreated with genipin, CK-MB and MDA levels decreased and SOD activity increased significantly compared with the high glucose group(P<0.05).ConclusionGenipin can attenuates significantly high glucose-induced oxidative injury in H9c2.

KeywordsHigh glucose; Genipin; Oxidative injury; H9c2 cells

糖尿病性心肌病，主要發(fā)病機(jī)制之一是長期高濃度血糖作用下，心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，產(chǎn)生大量氧自由基及活性氧，會(huì)直接損傷心肌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡增加，心臟功能會(huì)發(fā)生障礙，嚴(yán)重可能危及患者生命[1，2]。利用有效的抗氧劑能對(duì)糖尿病性心肌病具有很好的保護(hù)作用。京尼平是從天然植物梔子花和果實(shí)中提取的強(qiáng)抗氧化劑，小劑量應(yīng)用天然無毒，易被機(jī)體細(xì)胞吸收[3]。京尼平是線粒體內(nèi)膜解偶連蛋白(UCP2)的特異性阻斷劑，能防治多種發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的疾病，例如缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有明顯抑制作用，能有效保護(hù)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減輕脊髓小腦神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷等作用[4～8]。但京尼平在糖尿病心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用的報(bào)道不多，本研究建立高糖細(xì)胞氧化損傷模型，研究京尼平在高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化損傷中的作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(編號(hào)：GNR5，上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；京尼平(美國Cayman公司)；DMEM和特級(jí)胎牛血清(美國Gibco公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、肌酸激酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 (杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和分組：(1)37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞系H9c2：DMEM培養(yǎng)液，含10%胎牛血清。(2)對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞分為4組：①正常糖對(duì)照組(NC組)：5.6mmol/L葡萄糖濃度;②正常糖+京尼平組(NC+GEN組)：正常糖中加10μmol/L濃度京尼平;③高糖損傷組(HG組)：33.3mmol/L葡萄糖濃度;④高濃度葡萄糖+京尼平組(HG+GEN組)：高濃度糖中加10μmol/L濃度京尼平。

3.CCK-8 法檢測各組H9c2心肌細(xì)胞存活率：對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，分組培養(yǎng)48h，胰酶消化后，細(xì)胞懸液以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)復(fù)孔5個(gè)，棄上清，每孔加100μl完全培養(yǎng)基后，再加10μl CCK-8試劑，輕緩的晃動(dòng)培養(yǎng)板，使試劑和培養(yǎng)基混勻，空白對(duì)照不加細(xì)胞懸液只加110μl CCK-8試劑，再置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h，在450nm波長處檢測吸光度(A)值，再換算成細(xì)胞存活率比較。

4.細(xì)胞體外培養(yǎng):使細(xì)胞同步于G0期，不同因素分組培養(yǎng)48h后，按試劑盒說明書操作，收集細(xì)胞懸液于離心管中,1500r/min,離心5min,棄上清液,用1×Binding buffer將細(xì)胞調(diào)整至1×106個(gè)/毫升濃度,取400μl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至5ml 流式專用試管,分別加入FITC標(biāo)記的5μl Annexin-Ⅴ，再加入10μl PI溶液，陰性對(duì)照不加AnnexinⅤ-FITC及PI，混勻,避光孵育5min后快速檢測。

5.H9c2細(xì)胞:用0.25%胰酶、0.02% EDTA消化，以(1.5～2.0)×105個(gè)/毫升接種于100mm培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24h后。細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)按試劑盒說明書操作，各組不同條件培養(yǎng)48h后，相應(yīng)波長處測定各組細(xì)胞吸光度(A)值，再換算成細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CK-MB含量和細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活力，比較各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

結(jié) 果

1.CCK-8 法檢測不同濃度的京尼平對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響：正常糖細(xì)胞即對(duì)照組，5μmol/L和10μmol/L京尼平加入正常糖后的細(xì)胞存活率變化較小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20μmol/L和40μmol/L京尼平濃度加入時(shí)，細(xì)胞存活率明顯逐漸下降(P<0.05，圖1)，對(duì)正常糖細(xì)胞存活率低于50%，影響較大，故用10μmol/L京尼平為應(yīng)用濃度。

圖1 CCK-8 法檢測正常糖條件下加入不同濃度京尼平對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響與0μmol/L組比較，*P<0.05

2.CCK-8 法檢測京尼平對(duì)高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率影響：根據(jù)前期研究，選擇33.3mmol/L高濃度葡萄糖作用48h誘導(dǎo)氧化應(yīng)激心肌細(xì)胞損傷模型，10μmol/L京尼平對(duì)正常糖細(xì)胞存活率影響較小，作為作用濃度。CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率，高糖損傷組(HG組)與正常糖對(duì)照組(NC組)比較顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；京尼平保護(hù)組(HG+GEN組)與高糖損傷組(HG組)比較，細(xì)胞存活率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)，10μmol/L京尼平對(duì)高糖損傷的細(xì)胞可提高細(xì)胞存活率。

圖2 CCK-8 法檢測10μmol/L京尼平對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響與NC組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

3.AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞儀法檢測細(xì)胞凋亡： AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測, 在雙變量FCM 的散點(diǎn)圖上表示細(xì)胞情況。左上象限(UL)：細(xì)胞碎片和壞死細(xì)胞；左下象限(LL)：正常細(xì)胞；右下象限(LR)：早期凋亡細(xì)胞；右上象限(UR)：晚期凋亡和少量壞死細(xì)胞(圖3)。比較各組LR象限的細(xì)胞早期凋亡比率，NC+GEN組的細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞(圖3B) 與NC組(圖3A)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HG組細(xì)胞與NC組比較，早期凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3C)。HG+GEN組與HG組比較早期凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3D)。

圖3 AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞散點(diǎn)圖A.NC組(5.6mmol/L 葡萄糖); B.NC+GEN組(5.6mmol/L 葡萄糖+10μmol/L 京尼平); C.HG組 (33.3mmol/L 葡萄糖); D.HG+GEN組(33.3mmol/L 葡萄糖+10μmol/L 京尼平)；與NC組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CK-MB水平和細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD活性的測定：細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CK-MB水平，反映心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷程度。高糖組(HG組)與對(duì)照組(NC)比較，CK-MB、MDA 含量明顯增高，SOD 含量顯著下降(P<0.05)。但給予10μmol/L京尼平后，與HG組比較，其CK-MB、MDA含量明顯下降，SOD 含量顯著上升(P<0.05，表1)。

表1 各組CK-MB、MDA、SOD 含量的比較

討 論

糖尿病患者血糖長期偏高狀態(tài)，會(huì)引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷已經(jīng)得到證實(shí)，有效保護(hù)心肌細(xì)胞免受或減少氧化應(yīng)激損傷成為研究的熱點(diǎn)[9,10]。京尼平是傳統(tǒng)中藥梔子、杜仲等植物中提取的有效抗氧化劑，是一種特異的羥基清除劑，有效清除活性氧和自由基，具有多重抗氧化應(yīng)激和保護(hù)線粒體功能的作用，已經(jīng)證明在防治糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)損害、視網(wǎng)膜病變、腎病及心血管系統(tǒng)疾病等多種病癥中，可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激保護(hù)作用[11～15]。在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究京尼平在糖尿病心肌病中的作用[16]。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)中建立了33.3mmol/L高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型，CCK-8法測定多種不同濃度京尼平對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響，10μmol/L京尼平對(duì)正常糖組的細(xì)胞存活率沒有影響，卻能使高糖條件心肌細(xì)胞存活率提高，說明京尼平能一定程度的保護(hù)高糖環(huán)境的心肌細(xì)胞，減少損傷的程度[17,18]。機(jī)體細(xì)胞損傷會(huì)使細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞凋亡狀態(tài)可以直接反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度，二者密切相關(guān)，抑制細(xì)胞早期凋亡，細(xì)胞損傷能可逆性改變，AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞儀法檢測10μmol/L京尼平減少了高糖環(huán)境的早期凋亡細(xì)胞率，進(jìn)一步說明京尼平對(duì)高糖環(huán)境心肌細(xì)胞損傷有很好的抑制作用。

高糖環(huán)境導(dǎo)致心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的酶系統(tǒng)破壞，氧化應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞將產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)平衡失調(diào)，脂質(zhì)過氧化也會(huì)損傷細(xì)胞的機(jī)能，增加心肌細(xì)胞凋亡和損傷的程度。細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)酶CK-MB會(huì)大量釋放，CK-MB是心肌細(xì)胞內(nèi)含量較多的肌酸激酶的一種同工酶，心肌細(xì)胞損傷早期就會(huì)大量釋放出來，測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CK-MB活性可反映細(xì)胞損傷程度，含量的增加是細(xì)胞不可逆損傷的標(biāo)志[19]。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物，其含量越高說明脂質(zhì)過氧化的程度越高，從而反映細(xì)胞受過氧化損傷的程度[20]。SOD是心肌細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化應(yīng)激酶，其活性的高低可反映出細(xì)胞清除氧自由基的能力，直接反映著細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力[21]。檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CK-MB，細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD的含量，高糖組與對(duì)照組比較，CK-MB、MDA含量明顯增高，SOD含量顯著下降，而京尼平保護(hù)組與高糖組比較，CK-MB、MDA含量明顯下降，SOD含量顯著升高，這說明一定濃度的京尼平是通過抗氧化系統(tǒng)的作用來保護(hù)高糖環(huán)境的心肌細(xì)胞，減少氧化應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制與減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物的釋放，平衡抗氧化應(yīng)激酶系統(tǒng)，抑制線粒體損傷途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路應(yīng)激有關(guān)，有利于損傷細(xì)胞的自我修復(fù)，進(jìn)而減輕糖尿病心肌細(xì)胞損傷，與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能變化相關(guān)的一系列酶蛋白的調(diào)控作用及其抗氧化機(jī)制將進(jìn)一步研究，在有效防治糖尿病心肌病方面發(fā)揮作用。