lnc-HOTAIRM1 RT-qPCR檢測在APL治療中的臨床應用價值

楊慧潔 張佳麗 虞莉莎 殷雪瑞 鄭曉群 陳占國

ClinicalValueofQuantitativeDetectionoflnc-HOTAIRM1RT-qPCRintheTreatmentofAPL.YangHuijie,ZhangJiali,YuLisha,etal.DepartmentofLaboratoryMedicine,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Zhejiang325000,China

AbstractObjectiveTo establish a real-time quantitative PCR (RT-qPCR) method for the quantitative peripheral blood (PB) lnc-HOTAIRM1, and to explore its clinical application value in the treatment of APL.MethodsThe expression of NB4 cell line induced by ATRA was analyzed. The amplification system and amplification conditions of RT-qPCR were optimized, and the PB lnc-HOTAIRM1 RT-qPCR detection method was established. Finally, the clinical value of PB lnc-HOTAIRM1 detection in monitoring APL treatment was evaluated.ResultsThe lnc-HOTAIREM1 RT-qPCR amplification system and amplification conditions were successfully optimized. The relative expression of lnc-HOTAIREM1 increased gradually with the increase of ATRA-induced differentiation time in NB4 cell line (P<0.05). In RT-qPCR detection for clinical PB samples, the relative expression level of lnc-HOTAIREM1 in APL group was lower than that in non-APL group and normal control group (P<0.01). Compared with APL before treatment, the relative expression of lnc-HOTAIREM1 in APL after treatment was significantly up-regulated (P<0.01).ConclusionThere were differences in the expression of PB lnc-HOTAIREM1 among APL group, non-APL group and normal control group. lnc-HOTAIREM1 was associated with APL induced differentiation, and the expression of lnc-HOTAIREM1 in APL after treatment was significantly up-regulated. The established RT-qPCR for the quantitative detection of PB lnc-HOTAIREM1 can be used for the differential diagnosis and minimal residual leukemia (MRD) assessment for APL patients.

KeywordslncRNA;Acute promyelocytic leukemia;RT-qPCR; Treatment

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)發病兇險且病死率高，早期診斷和及時治療可降低病死率并提高治愈率[1]。目前全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)和三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)在APL靶向治療中得到較好的應用，但仍有部分APL患者產生治療耐藥[2～5]。因此APL患者需長期地進行微小殘留白血病(minimal residual disease，MRD)監測以期早期發現白血病耐藥或復發[6]。臨床普遍采用基于骨髓PML-RARɑ融合基因實時熒光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測來反映APL患者的MRD狀態，然而骨髓穿刺具有創傷性，APL治療期間反復進行骨髓穿刺會增加患者痛苦且存在感染風險。因此在APL治療過程中，很有必要找到能替代骨髓PML-RARɑ進行MRD監測的分子標志物。

在APL靶向治療過程中，針對治療方案的選擇、療效評估、MRD監測及繼發耐藥監測，外周血是骨髓的最佳替代。因此，尋找無創的外周血分子標志物迫在眉睫。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNA)在APL細胞分化中發揮重要的調控作用，可作為反映APL治療的分子標志物[7～9]。研究表明，HOXA轉錄本反義RNA髓樣特異性1(HOTAIRM1)為上調的lncRNA與APL細胞分化相關，但外周血lnc-HOTAIRM1作為分子標志物的臨床應用價值尚不清楚[10]。本研究擬通過ATRA誘導NB4細胞株分析lnc-HOTAIRM1表達規律，并建立外周血lnc-HOTAIRM1 RT-qPCR檢測方法，最后評價外周血lnc- HOTAIRM1 RT-qPCR檢測在APL治療中的臨床應用價值。

對象與方法

1.研究對象：本研究共收集60例于筆者醫院初診為急性白血病的臨床樣本，其中APL 30例，非APL(急性淋巴細胞白血病和除APL以外的急性髓細胞白血病)30例。所有病例中，男性38例，女性22例，患者年齡3～78歲，中位年齡為49歲。同時收集30例年齡與性別匹配的正常對照樣本。分別留取APL治療前和治療完全緩解后的EDTA抗凝全血標本，另外留取其余研究對象的EDTA抗凝全血標本，所有全血標本經紅細胞裂解后TRIzol凍存。所有白血病診斷采用WHO2016 AML分型標準，APL治療參照最新的NCCN指南。研究對象納入標準：①初診APL患者未接受任何誘導分化治療；②正常對照排除血液系統疾病無合并其他惡性腫瘤。排除標準：①未明確診斷患者；②APL治療未參照最新NCCN指南的患者。所收集患者樣本與所有患者簽訂書面知情同意書，獲得了溫州醫科大學附屬第二醫院醫學倫理學委員會的許可。

2.主要儀器和試劑：ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4(由溫州醫科大學附屬第一醫院惠贈)、引物及MGB探針(上海奕躍生物科技有限公司)、ATRA(美國Sigma 公司)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Scientific公司)、TaqMan Universal PCR Master Mix Ⅱ, no UNG(美國ABI公司)、紅細胞裂解液(美國Solarbio公司)、RPMI1640 細胞培養液(美國Gibco 公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、白血病PML-RARɑ融合基因檢測試劑盒(上海源奇公司)。

3.引物和MGB探針：由上海奕躍生物科技有限公司合成，引物和探針序列見表1。

表1 HOTAIRM1和人GAPDH的引物與探針序列

4.外周血標本的處理：取1～2 ml外周血標本，3500r/min離心5min后棄血漿，加入等量的0.9%氯化鈉溶液，充分混勻后移至15ml離心管，加入10ml紅細胞裂解液進行紅細胞裂解。嚴格按照說明書操作，得到細胞沉淀，確保沒有紅細胞，若有紅細胞再裂解1次。在細胞沉渣中加入1ml TRIzol振蕩混勻，讓細胞充分溶解移至2ml細胞凍存管，室溫放置5min，最后于-80℃冰箱暫時保留或直接用于下一步的總RNA提取。

5.細胞培養：NB4細胞株培養于1640培養基(含10%滅活胎牛血清、1%雙抗)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養。

6.ATRA誘導細胞實驗：實驗細胞數2×106/ml，ATRA藥物干預終濃度10-6mol/L。以不加藥的細胞懸液為對照，每瓶細胞懸液含量均為10ml。實驗組(含10-6mol/L終濃度ATRA的細胞懸液)分為實驗組0h、實驗組24h、實驗組48h和實驗組72h，對照組(不添加ATRA誘導分化劑)分為對照組0h、對照組24h、對照組48h和對照組72h。將細胞培養瓶放置37℃、5%CO2培養箱分別避光培養0、24、48、72h后，將細胞懸液1000r/min 離心 5min，取200μl 0.9%NaCl溶液洗滌沉淀后的細胞懸液進行涂片，剩余細胞用TRIzol凍存。

7.lnc-HOTAIRM1以及內參基因GAPDH RT-qPCR擴增條件優化：同一反應條件均重復3次，每次設置水空白、陰性對照和陽性對照。擴增條件優化時根據美國Applied Biosystems公司提供的說明書，采用20μl 反應體系，程序：UNG酶激活50℃ 2min,預變性95℃ 10min,變性95℃ 15s，退火溫度梯度58℃、59℃、60℃和61℃ 60s,循環數45。確定退火溫度后，探針濃度分別取50、300和900nmol/L；引物濃度分別取50、300和900nmol/L，通過正交試驗，比較擴增曲線和CT值，確定最佳引物探針濃度。

8.RT-qPCR檢測細胞株及臨床標本lnc-HOTAIRM1的表達規律：將TRIzol法提取的總RNA進行反轉錄后，以cDNA為模板利用優化后的最終反應條件進行RT-qPCR反應，同時設置水空白、陰性對照和陽性對照。

9.骨髓PML-RARɑ融合基因檢測：采用上海源奇公司的白血病PML-RARɑ融合基因檢測試劑盒檢測骨髓PML-RARɑ表達，嚴格按照說明書操作。

10.統計學方法：應用 SPSS 22.0統計學軟件對數據進行統計分析，基因相對表達量應用GraphPad 5.0做圖，基因分析結果采用內參基(GAPDH)校正lnc-HOTAIRM1的相對表達量，采用2-△△Ct表示。用Wilcoxon秩和檢驗分析基因的差異性表達[11]，lnc-HOTAIRM1的相對表達量和PML-RARα相關性分析采用Spearman秩相關法，以P< 0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.TaqMan探針法lnc-HOTAIRM1反應條件優化結果：RT-qPCR體系20μl，程序：預變性95℃ 10min；變性95℃ 5s，退火溫度梯度57℃、59℃、60℃和61℃，延伸時間為60s，循環數45。將基線調成一致后，結果顯示，退火溫度59℃和60℃時擴增曲線呈“S”形趨勢，59℃時熒光值較高、CT值較小，擴增曲線見圖1，故選擇59℃作為最終的退火溫度。

圖1 HOTAIRM1反應條件優化結果RT-qPCR擴增曲線圖A、B、C、D分別代表退火溫度為58 ℃、59 ℃、60 ℃和61 ℃的擴增曲線；ΔRn.熒光值

2.TaqMan探針法GAPDH反應條件優化結果：根據Applied Biosystems公司提供的說明書，擴增體系20μl，程序：預變性95℃ 10min；變性95℃ 5s，退火溫度梯度58℃、59℃、60℃和61℃，延伸時間為60s，循環數45。將基線調成一致后，退火溫度58℃、59℃以及60℃時擴增曲線呈“S”形趨勢，59℃時熒光值較高、CT值較小，擴增曲線見圖2，故選擇59℃作為最終退火溫度。

圖2 GAPDH反應條件優化結果RT-qPCR擴增曲線圖A、B、C、D分別代表退火溫度為58℃、59℃、60℃和61℃的擴增曲線;ΔRn.熒光值

3.RT-qPCR最終體系：綜合對lnc-HOTAIRM1和 GAPDH的擴增條件及擴增體系優化結果分析，同時考慮實驗操作的簡便性，最終確定優化條件和優化體系結果。lnc-HOTAIRM1和 GAPDH的優化結果統一為體系20μl：模板2μl、TaqMan Universal PCR Master MixⅡ, no UNG(2×) 10μl、上下游引物(10μmol/L) 0.6μl、MGB探針(10μmol/L) 0.4μl、無酶水6.4μl。程序：預變性95℃ 10min；變性95℃ 5s，退火59℃ 60s，循環數45。

4.NB4 細胞株中lnc-HOTAIRM1的相對表達量：NB4細胞株經ATRA誘導分化24、48和72h后，lnc-HOTAIRM1的相對表達量隨著誘導時間的增加而增加，分別是對照組的1.60倍、3.16倍和5.13倍，與對照組0h比較呈現上調趨勢(圖3)，各個時間點與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖3 經ATRA誘導后NB4 細胞株中lnc-HOTAIRM1的表達情況*P<0.01

5.lnc-HOTAIRM1在APL及非APL和正常對照中的表達結果：APL治療前外周血lnc-HOTAIRM1的相對表達量較非APL低(P<0.01)；APL治療前外周血lnc-HOTAIRM1的相對表達量較正常對照低(P<0.01)。比較治療APL治療前后的外周血標本，APL治療后完全緩解外周 lnc-HOTAIRM1的相對表達量遠高于APL治療前外周血lnc-HOTAIRM1的相對表達量(P<0.01，圖4)。

圖4 lnc-HOTAIRM1在APL和非APL、APL和正常對照、APL治療前后的表達情況NAPL.ALL和除APL以外的AML；APL.治療前急性早幼粒細胞白血病患者；APL-CR.治療后完全緩解的急性早幼粒細胞白血病患者；*P<0.01

6.APL患者治療前后外周血lnc-HOTAIRM1與骨髓PML-RARα相關性分析：APL患者治療前后外周血lnc-HOTAIRM1與其對應的骨髓PML-RARα/ABL檢測結果呈負相關(P=0.000，r=-0.98)，線性方程為y=-0.089x+0.614。APL患者外周血lnc-HOTAIRM1相對表達量越高，骨髓PML-RARα/ABL的值越小(圖5)。

圖5 APL患者治療前后外周血lnc-HOTAIRM1相對表達量與骨髓PML-RARα相關性

討 論

lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，在微小RNA(microRNA，miRNA)之后成為惡性腫瘤領域的研究熱點[12, 13]。lnc-HOTAIRM1是一種成熟于骨髓細胞中的高度特異性lncRNA，它在急性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病和霍奇金淋巴瘤的治療中有重要臨床價值[14～16]。有文獻證實，lnc-HOTAIRM1在APL細胞分化中起重要作用，在APL誘導分化過程中，lnc-HOTAIRM1表達受PU.1轉錄因子調節，且通過增強自噬途徑促進PML-RARα融合蛋白降解和髓細胞分化[7, 8]。因此，lnc-HOTAIRM1可能是APL治療的潛在靶標以及APL治療反應的指標。RT-qPCR是一種常規的分子生物學診斷方法，因其自身的高度特異性和便利性被廣泛應用于臨床[17]。

APL患者需要定期通過骨髓穿刺進行分子生物學檢查和形態學檢查以評估誘導分化效果，但長期的骨髓穿刺無疑會極大增加患者的痛苦，特別是對那些不能耐受骨髓穿刺或存在骨髓穿刺禁忌證的患者，進而影響臨床醫生對患者病情做出及時判斷，導致患者的治療效果不佳。靜脈抽血相對于骨髓穿刺風險要小，外周血的獲取相對于骨髓要簡便和快捷。迄今為止在APL治療中基于RT-qPCR技術檢測外周血lncRNA的相關文獻國內外尚未見報道。

本研究筆者通過ATRA誘導NB4細胞探究lnc-HOTAIRM1的表達規律，發現了lnc-HOTAIRM1的相對表達量在NB4細胞株中隨著ATRA誘導時間的增加而增加。這提示了在APL的細胞株中lnc-HOTAIRM1的表達規律是可信的，因此體外誘導NB4細胞實驗的結果為臨床治療前后的APL標本外周血lnc-HOTAIRM1的差異表達提供了有力的實驗室證據，從而驗證了外周血lnc-HOTAIRM1與APL治療有關。

本研究結果顯示，APL患者誘導分化后完全緩解的外周血lnc-HOTAIRM1相對表達量遠高于APL患者治療前的外周血lnc-HOTAIRM1相對表達量(P<0.01)，這提示了在APL患者治療監測中可以通過檢測外周血lnc-HOTAIRM1的表達水平來評估APL的治療效果。APL患者治療前的外周血lnc-HOTAIRM1相對表達量低于治療前非APL的其他白血病患者和正常對照的外周血lnc-HOTAIRM1相對表達量(P<0.01)，即外周血lnc-HOTAIRM1在APL患者與非APL白血病患者以及正常對照之間存在差異性表達，上述研究結果提示了lnc-HOTAIRM1可能可用于APL和非APL/正常人群的鑒別診斷。研究表明，某些關鍵lncRNA確實在白血病的發生、發展和治療中起著重要作用，lncRNA SBF2-AS1在AML患者治療中存在差異性表達，其可作為潛在治療靶點[18]。lncRNA H19通過參與破壞hTERT-hTR相互作用來阻止端粒酶功能，抑制APL的發生，因此H19可作為治療靶點。lncRNA RP11-87C12.5的表達在初診急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)和完全緩解ALL中存在差異，這對評估ALL治療效果有重要意義。有研究表明，在ALL中，lncRNA SNHG16下調抑制了ALL細胞的增殖，SNHG16在ALL中上調促進了ALL的發生[19]。

筆者將APL患者治療前后外周血lnc-HOTAIRM1與患者的骨髓PML-RARα檢測做比較，發現APL患者治療前后外周血lnc-HOTAIRM1相對表達量與骨髓PML-RARα呈負相關(P=0.000)。骨髓PML-RARα檢測是評估APL患者治療效果和進行MRD監測的一項關鍵的分子生物學檢查，本研究中APL患者治療前后外周血lnc-HOTAIRM1與骨髓PML-RARα相關，提示外周血lnc-HOTAIRM1在APL患者的療效評估和MRD監測方面存在一定的臨床價值。

綜上所述，本研究建立了外周血lnc-HOTAIRM1定量檢測的RT-qPCR方法，并在APL患者治療中進行臨床應用，證實外周血lnc-HOTAIRM1在APL治療前后存在差異性表達。本研究有望為APL的鑒別診斷、療效評估和MRD監測提供無創新型分子標志物，并為其他白血病治療監測提供了新策略。