Smoothened沉默胚胎成纖維細胞NIH/3T3的mRNA表達譜分析

劉董劍 梁亞冰 崔宏偉 張 巖 楊 凌

ExpressionProfileAnalysisofmRNAsintheEmbryoFibroblastCellLineNIH/3T3withSmoothenedKnockedDown.LiuDongjian,LiangYabing,CuiHongwei,etal.InnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongolia010110,China

AbstractObjectiveTo investigate the changes of mRNAs expression profile in mouse embryonic fibroblasts cell line NIH/3T3 after silencing the Hedgehog pathway by knocking down the Smoothened (Smo).MethodsTotal RNA from control and Smo knocked down NIH/3T3 cells was sequenced. The differentially expressed mRNA was compared with controls, and BLAST2GO and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) were used to analyze and predict the functions of these differentially expressed mRNAs. The accuracy of sequencing was verified by real-time quantitative PCR using selected differentially expressed mRNAs.ResultsA total of 2289 mRNAs were found differentially expressed by sequencing in Smo knocked down NIH/3T3 cells, of which 1646 mRNAs were down-regulated and 643 mRNAs up-regulated. The results of real-time quantitative PCR were consistent with those of sequencing. Bioinformatics analysis revealed that differentially expressed mRNAs may be involved in cellular process, single-organism process and biological regulation. Differentially expressed mRNAs were enriched in axon guidance (ko04360), pathways in cancer (ko05200), and microRNAs in cancer(ko05206). The expression and prognostic prediction of receptors of CXCL12, IL-33, TGF-β2 and FGF10 in esophageal and normal esophageal tissues were analyzed using the GEPIA database.ConclusionInhibition of Hedgehog pathway by Smo knocked down in NIH/3T3 cells may be inhibit the growth of tumor cells through CXCL12, IL-33, TGF-β2 and FGF10.

KeywordsMouse embryo fibroblast cell; Hedgehog pathway; Smoothened; Expression profile analysis of mRNAs

越來越多的研究表明，腫瘤微環境(TME)在腫瘤起始、發展和轉移中起到重要的作用。目前已知腫瘤微環境中包括成纖維細胞、免疫細胞、內皮細胞、神經細胞、脂肪細胞和細胞外基質。其中成纖維細胞又稱為腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)，表達α平滑肌肌動蛋白(SMA)。CAFs表達多種因子，包括生長因子、趨化因子和細胞因子來調節腫瘤細胞和腫瘤微環境中的其他成分。在食管鱗狀細胞癌中，CAFs參與了腫瘤的發生、血管生成、腫瘤增殖和轉移、腫瘤的免疫抑制。筆者的研究表明，小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3可以促進食管癌細胞的增殖，使用慢病毒沉默NIH/3T3細胞中的Smoothened(Smo)基因可以阻礙NIH/3T3細胞對食管癌細胞增殖的促進作用。筆者將Smo沉默(Smo-KD)的NIH/3T3細胞和對照細胞(Smo-NC)進行二代測序，對mRNA表達譜進行比較分析，為進一步闡明其中的分子機制奠定基礎。

材料與方法

1.細胞培養和增殖：食管癌細胞KYSE140培養在RPMI1640培養液中，添加10%的胎牛血清(FBS)，NIH/3T3 Smo-NC和Smo-KD細胞培養在DMEM培養液中，添加10%的FBS，非必需氨基酸和丙酮酸鈉。將KYSE140細胞分到96孔板中，分別加入NIH/3T3 Smo-NC和Smo-KD細胞上清液和對照培養基，放入IncuCyte?S3 活細胞分析系統(美國Essen BioScience公司)中觀察KYSE140細胞的增殖情況。

2.RNA提取和測序：按照說明書，使用TRIzol(美國Invitrogen公司)提取NIH/3T3 Smo-NC和Smo-KD細胞的總RNA。將RNA保存在干冰中郵寄至華大基因公司，進行建庫和測序。測序使用Illumina Hiseq平臺，每個樣品平均產出6.13GB的數據。使用DEseq2算法進行差異基因的分析，將fold change(差異倍數)≥2.00且P<0.05的mRNA定義為有差異表達的mRNA。差異表達的mRNA通過BLAST2GO 和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析預測其相關功能。

3.實時定量PCR：按照說明書，使用IScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒(美國Bio-Rad公司)，將總RNA進行反轉錄成cDNA，再使用iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix試劑盒(美國Bio-Rad公司)對測序得到的差異mRNA進行實時定量PCR，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，對測序的結果進行驗證。表1列出所用的引物序列。

4.GEPIA數據庫中CXCL12、IL-33、TGF-β2和FGF10及其受體在食管癌中的表達和預后預測分析：GEPIA 數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)可基于腫瘤基因組計劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)表達數據分析納入癌癥的轉錄組大數據[1]。利用GEPIA 數據庫分析CXCL12、IL-33、TGF-β2和FGF10及其受體CXCR4、IL-1RL1、TGFBR2和FGFR2在食管癌和正常食管組織中的表達情況和預后的預測分析。

5. 統計學方法：采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行統計分析，對細胞培養結果和實時定量PCR1. NIH/3T3 Smo-NC和Smo-KD細胞上清液對食管癌細胞增殖的影響：與對照培養基比較，NIH/3T3 Smo-NC和Smo-KD細胞上清液均對食管癌KYSE140細胞的增殖有促進作用，而Smo-KD細胞上清液的作用弱于Smo-NC細胞上清液的作用(圖1)。

表1 引物名稱和序列

結 果

圖1 NIH/3T3 Smo-NC和Smo-KD細胞上清液對食管癌KYSE140細胞的增殖作用與對照培養基比較，*P=0.000；與Smo-KD細胞上清液比較，#P<0.01

2.Smo沉默調節的差異表達基因譜：提取NIH/3T3 Smo-NC和Smo-KD細胞的總RNA，一同測序，發現有2289個mRNA差異表達，其中1646個mRNA在Smo后表達下調，而643個mRNA表達上調。在表達下調的結果中筆者發現Hedgehog通路的靶基因Ptch1、Gli1、Mmp9和PDGFRα都有下調，隨后的qRT-PCR結果與測序結果基本一致，證實了mRNA測序結果的可信性(圖2)。

圖2 qRT-PCR檢測沉默Smo基因后NIH/3T3細胞中差異表達基因的結果與NIH/3T3 Smo-KD細胞比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

3.差異表達mRNA的GO功能分析：Gene Ontology (GO)是基因功能國際標準分類體系，包含3個主要的分支，即生物學過程、分子功能和細胞組分。筆者根據差異表達mRNA在這3個方面富集的數目，對Smo沉默，降低Hedgehog通路活性后可能影響的生物學功能進行了分析(圖3)。其中，差異表達mRNA富集最多的生物學過程包括細胞過程、單有機體過程、生物學調節、代謝過程和生物學過程的調節等。這些差異表達的基因存在細胞內和細胞外，參與結合、催化活性、分子轉導活性、信號轉導活性和分子功能調節等。

圖3 差異表達mRNA的功能分析包括富集基因最多的生物學進程(前10位)，富集基因最多的細胞成分(前10位)和富集基因最多的分子功能(前10位)

4.差異表達mRNA的通路功能分析：通過KEGG的通路富集分析，筆者找到了差異表達mRNA富集的KEGG通路(表2)。Smo沉默導致Hedgehog通路活性下降影響了軸突導向(ko04360)、癌癥通路(ko05200)、癌癥中的microRNA(ko05206)、致心律失常性右心室心肌病(ko05412)、細胞外基質受體相互作用(ko04512)等。

5.GEPIA 數據庫預測分析：測序和驗證結果中顯示沉默NIH/3T3細胞中的Hh通路關鍵分子Smo后，趨化因子CXCL12、IL-33和生長因子TGF-β2、FGF10的表達也下降了。利用GEPIA 數據庫分析CXCL12、IL-33、TGF-β2和FGF10及其受體CXCR4、IL-1RL1、TGFBR2和FGFR2在食管癌和正常食管組織中的表達情況，和預后的預測分析。首先對比、分析了286例正常食管組織與182例食管癌組織中CXCL12、IL-33、TGF-β2和FGF10及其受體CXCR4、IL-1RL1、TGFBR2和FGFR2的表達水平。食管癌組織中CXCL12、IL-33和FGF10的基因表達水平低于正常的組織(CXCL12和IL-33：P<0.05)，而食管癌中TGF-β2的表達高于正常組織 (P<0.05)。CXCR4和TGFBR2的基因表達水平高于正常食管組織，IL1RL1和FGFR2水平在癌組織和正常組織中比較，差異無統計學意義。對預后的分析顯示，CXCL12、IL-33、TGF-β2和FGF10及其受體CXCR4、IL-1RL1、TGFBR2和FGFR2的表達差異對患者的預后趨勢無明顯的影響(圖4)。

表2 富集差異表達mRNA的KEGG通路

圖4 利用GEPIA 數據庫中食管癌的信息分析食管癌組織和正常組織中CXCL12、IL-33、TGF-β2和FGF10及其受體CXCR4、IL-1RL1、TGFBR2和FGFR2基因的表達情況和預后的預測

討 論

由于目前沒有商品化的人食管癌成纖維細胞，所以本實驗使用的成纖維細胞為小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3，其表達CAFs的標記蛋白SMA。筆者在NIH/3T3細胞中得到的結果后續會使用原代培養的食管癌CAFs和食管癌組織進行驗證。將NIH/3T3與腫瘤細胞共同培養后，腫瘤細胞的增殖加快。NIH/3T3細胞應答Hh配體，研究發現多種腫瘤細胞都分泌Hh配體，所以本研究沉默NIH/3T3細胞中的Hh通路關鍵分子Smo，并進行了轉錄組的測序，希望能從中發現NIH/3T3細胞促進腫瘤細胞增殖的關鍵分子。測序和驗證的結果顯示，在NIH/3T3細胞中敲減了Smo基因后，Hh靶基因Ptch1、Gli1和Mmp9的表達均有下降。筆者還發現了一些趨化因子CXCL12、IL-33和生長因子TGF-β2、FGF10的表達也下降了。

研究發現，抑制CAFs中CXCL12/CXCR4/CCR7免疫抑制信號軸的表達，可以增加胰腺癌中CCR7效應記憶T細胞浸潤，增加腫瘤特異性IFN-γ的表達和提高存活率[2]。在乳腺癌中的研究也證實CXCL12/CXCR4可以促進免疫抑制，而抑制了CXCR4信號后降低了腫瘤基質的纖維化程度，增加了細胞毒性T淋巴細胞的滲透[3]。除了在腫瘤免疫中的作用，在胃癌和結腸癌中的研究發現，CXCL12/CXCR4軸還可以促進腫瘤細胞的增殖和轉移[4,5]。研究發現，在腫瘤中IL-33也有著兩方面的作用。腫瘤基質和血清中的IL-33通過調節性T細胞和骨髓樣來源的抑制細胞促進了免疫抑制；同時，IL-33還可以促進結直腸癌、口腔鱗狀細胞癌和頭頸部鱗狀細胞癌中腫瘤細胞的轉移[6～9]。

研究發現，TGF-β2在內皮細胞轉化為CAFs的過程中起到重要的作用，通過ELK1和心肌相關轉錄因子(MRTF)促進內皮細胞向間質細胞的轉化[10,11]。其中，FGF可以與TGF-β2協同作用，促進活性成纖維細胞的形成[10]。還有研究報道在結直腸癌中，缺氧誘導因子(HIF-1α)和CAFs分泌的TGF-β2一起，激活腫瘤干細胞中Hedgehog通路轉錄因子Gli2的表達，從而保持腫瘤干細胞的干性、增強化療抗性[12]。口腔鱗狀細胞癌中，CAFs分泌TGF-β1和TGF-β2，誘導上皮細胞的上皮-間質轉化，并下調細胞黏附分子[11]。前列腺癌的CAFs中表達高水平的FGF10和TGF-β2，可以增加腫瘤細胞的增殖和侵襲[13]。

綜上所述，本研究中測序和驗證發現沉默Smo的NIH/3T3中差異表達分子的作用可以分為3種類型：①與CAFs自身的形成和活化有關；②參與腫瘤微環境的免疫抑制作用；③參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和放化療的抵抗。說明在成纖維細胞中抑制Hedgehog通路可能會抑制CAFs自身的活性，減輕腫瘤微環境中的免疫抑制，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲，提高對放化療的敏感度。根據文獻報道和本研究結果，筆者推測成纖維細胞NIH/3T3分泌的細胞因子CXCL12、IL-33、TGF-β2和FGF10可能影響腫瘤細胞的增殖，在今后的研究中，筆者會繼續深入研究具體的分子機制，并希望可以找到臨床腫瘤治療的應用于CAFs的新靶標。