血清可溶性間皮素相關(guān)蛋白早期診斷大鼠惡性胸膜間皮瘤的實(shí)驗(yàn)研究

江 杰 文 亮 吳 莉 謝曉潔 趙 雯 韓 丹

ExperimentalStudyonDiagnosisofRatsMalignantPleuralMesotheliomawithSerumSolubleMesothelin-relatedPeptides.JiangJie,WenLiang,WuLi,etal.MedicalImagingDepartment,TheFirstAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Yunnan650032,China

AbstractObjectiveTo investigate the value on early diagnosis of experimental rats malignant pleural mesothelioma according to the serum level of soluble mesothelin-related peptides(SMRP), providing theoretical basis and experimental basis for early screening high-risk groups.MethodsThe expression of MPM SMRP in rats was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the differences in the SMRP expression were analyzed in different tumour stages, pathological types and the degree of histological differentiation. The ROC curve was used to obtain the diagnostic efficiency of early diagnosis of MPM.ResultsThere were statistically significant differences in the SMRP expression in MPM different stages and degrees of differentiation (P<0.05). The higher the stage, the higher the expression of SMRP. The lower the degree of differentiation, the higher the SMRP expression. However, there was no significant difference in expression among different pathological types (P>0.05). The AUC value of SMRP for T1, T2, T3, T4were 0.83, 0.86, 0.92, 0.85, the sensitivity and specificity were 100.0%, 88.2%, 100.0%, 85.7%, 71.4%, 100.0%, 87.5%, 100.0%, respectively, and the diagnostic threshold was 1.90, 4.53, 8.73, 11.97mmol/ml. Moreover, the AUC value of SMRP for N1, N2, N3were 0.59, 0.84, 0.92, respectively, and the sensitivity and specificity were 100.0%, 100.0%, 47.1%, 100.0%, 64.0%, 100.0%, respectively. The AUC value of SMRP for M1were 0.88, and the sensitivity and specificity were 75.0%, 100.0%, respectively.ConclusionSMRP can be used as an important biochemical indicator for screening of high-risk population of MPM.

KeywordsMesothelium；Soluble mesothelin-related peptides；Mesothelioma；Malignant pleural mesothelioma

惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma, MPM)是來(lái)源于漿膜間皮細(xì)胞的少見高度惡性腫瘤,早期常無(wú)任何臨床癥狀及體征，出現(xiàn)異常時(shí)多處于腫瘤中晚期，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量及預(yù)后，如何早期診斷MPM是業(yè)界研究的熱點(diǎn)[1，2]。影像學(xué)檢查是MPM診斷及鑒別診斷的重要手段，尤其是高分辨率CT檢查常作為首選檢查，但早期腫瘤CT檢查常表現(xiàn)正常或難以與其他病變鑒別[3]。如何尋求一種更為敏感的生物學(xué)標(biāo)志物為早期診斷提供信息成為新的研究方向。間皮素是一種重要的標(biāo)志物，在胸膜間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌中存在高表達(dá)[4～7]。目前研究主要集中在卵巢癌，對(duì)于胸膜間皮瘤研究較少，并且部分研究是分析胸腔積液、腫瘤組織內(nèi)的間皮素表達(dá)情況，血清研究較少，國(guó)內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道，而血清最容易獲取，具有臨床可操作性。因此本研究通過(guò)ELISA方法檢測(cè)大鼠MPM 間皮素表達(dá)情況，為早期診斷MPM提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象: 100只SD大鼠，雌雄各50只，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK(滇) K2015-0002。采用胸膜腔閉式注射青石棉纖維混懸液誘發(fā)MPM[3]。共獲得MPM 72例，其中上皮型21例(29.2%)，肉瘤型37例(51.4%)，混合型14例(19.4%)。根據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)最新TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[8]：T1期12例，T2期22例，T3期30例，T4期8例；N0期 49例，N1期 15例，N2期8例；M0期65例，M1期7例。臨床分期[4]：早期18例，中期25例，晚期7例。分化程度：低分化45例，高分化27例。

2.實(shí)驗(yàn)方法: 采用ELISA法測(cè)定血清SMRP 濃度，SMRP檢測(cè)試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。酶標(biāo)儀：Molecular PECTRAMAX190(美國(guó)Molecular Devices公司)。抽取大鼠尾靜脈血1ml，室溫靜置凝固后，離心20min，取上清液待測(cè)。采用雙抗體ELISA法，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，使用ELISA calc軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和A值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，根據(jù)所得回歸方程即可算出待測(cè)樣本中SMRP的含量。分析不同分期、不同病理類型、不同分化程度MPM的SMRP表達(dá)差異。

結(jié) 果

1.不同分期MPM的血清SMRP表達(dá): 不同分期MPM的血清SMRP表達(dá)差異比較采用t或F檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著分期增高，SMRP表達(dá)量增加(表1，圖1)。

表1 不同TNM分期SMRP表達(dá)差異

圖1 MPM不同TNM分期的SMRP表達(dá)柱形圖A.T分期；B. N分期；C. M分期

2.不同病理類型、不同分化程度MPM的SMRP表達(dá): 72例MPM中,上皮型21例，肉瘤型37例，混合型14例，不同病理類型的相同TNM分期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低分化45例，高分化27例，SMRP表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低分化組平均SMRP表達(dá)量(11.47±2.35mmol/ml)明顯高于高分化組(6.29±1.73mmol/ml)。

3. MPM臨床分期中SMRP表達(dá)差異比較: MPM不同臨床分期SMRP的表達(dá)量為早期3.65±1.05mmol/ml,中期7.52±3.36mmol/ml，晚期13.57±1.13mmol/ml，比較采用方差分析，兩兩比較則用LSD檢驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=341.63，P<0.05)，MPM越早期，SMRP表達(dá)量越低。

4.SMRP對(duì)不同分期MPM的診斷效能: SMRP對(duì)MPM T、N、M分期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)MPM T1期ROC曲線下AUC=0.83，最佳臨界值是1.90mmol/ml，敏感度為100.0%，特異性為88.2%；對(duì)T2期ROC曲線下AUC=0.86，最佳臨界值是4.53mmol/ml，敏感度為100.0%，特異性為85.7%；對(duì)T3期ROC曲線下AUC=0.92，最佳臨界值是8.73mmol/ml，敏感度為71.4%，特異性為100.0%；對(duì)T4期ROC曲線下AUC=0.85，最佳臨界值是11.97mmol/ml，敏感度為87.5%，特異性為100.0%。對(duì)N0期ROC曲線下AUC=0.59，敏感度為100.0%，特異性為100.0%；對(duì)N1期ROC曲線下AUC=0.84，敏感度為47.1%，特異性為100.0%；對(duì)N2期ROC曲線下AUC=0.92，敏感度為64.0%，特異性為100.0%。對(duì)M1期ROC曲線下AUC=0.88，敏感度為75.0%，特異性為100.0% (表2)。

表2 SMRP對(duì)不同MPM分期的診斷價(jià)值

討 論

惡性胸膜間皮瘤具有早期不易診斷、惡性程度及病死率高、治療效果不佳、患者生存質(zhì)量及預(yù)后差等特點(diǎn)。腫瘤具體發(fā)病機(jī)制尚未詳細(xì)闡明，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，MPM的主要致病因素是石棉暴露，而石棉潛伏期很長(zhǎng)，可達(dá)20～40年，患者早期一般無(wú)任何臨床癥狀，出現(xiàn)咳嗽、咳痰、胸悶、胸腔積液等腫瘤多屬中晚期，此時(shí)預(yù)后極差，尚無(wú)有效的治療方式[9]。有研究統(tǒng)計(jì)腫瘤處于中晚期對(duì)提高患者生存期無(wú)明顯價(jià)值，中位生存率約為9～14個(gè)月[10]。而早期診斷、治療MPM可明顯提高患者的生存期，并可明顯改善生存質(zhì)量及預(yù)后。因此對(duì)有石棉暴露史的高危人群進(jìn)行早期篩查、診斷具有重要的臨床價(jià)值。惡性胸膜間皮瘤的TNM分期對(duì)于分析腫瘤診斷、治療、預(yù)后具有重要指導(dǎo)價(jià)值，術(shù)前臨床分期以CT檢查作為參考，但早期腫瘤CT常表現(xiàn)正常，對(duì)早期診斷價(jià)值不大。因此如何提高CT檢查陰性表現(xiàn)、無(wú)法鑒別的早期MPM是業(yè)界面臨的最大挑戰(zhàn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)檢測(cè)分子生物學(xué)標(biāo)志物可能為早期診斷MPM提供新的思路。

目前非侵入性檢測(cè)分子標(biāo)志物早期診斷MPM是研究的熱點(diǎn)，其中間皮素是目前研究最廣泛的生物學(xué)標(biāo)志物之一，也是被食品藥物管理局認(rèn)可的用于診斷MPM的唯一生物學(xué)標(biāo)志物[5]。人類間皮素基因，也被稱為可溶性間皮素相關(guān)蛋白，是一種僅表達(dá)在間皮細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞表面抗原，通過(guò)激活NF-κB途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、增殖，導(dǎo)致白介素- 6水平升高。目前研究認(rèn)為間皮素可能與腫瘤發(fā)生形成、轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)，與腫瘤分期及腫瘤負(fù)荷有關(guān)，可作為一種預(yù)后指標(biāo)、評(píng)價(jià)病變進(jìn)展及對(duì)治療的反應(yīng)[11～15]。但在對(duì)MPM中間皮素表達(dá)的研究中，還存在不少爭(zhēng)議，有研究檢測(cè)胸腔積液、腫瘤組織內(nèi)間皮素表達(dá)情況，但MPM患者出現(xiàn)胸腔積液多屬中晚期，所以分析胸腔積液的SMRP對(duì)早期診斷MPM臨床意義可能不大，檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)間皮素表達(dá)對(duì)術(shù)前診斷意義也不大。也有研究認(rèn)為SMRP與MPM進(jìn)展、總生存率之間沒有相關(guān)性，但也有研究證明SMRP水平與總體生存年限呈負(fù)相關(guān)[16]。因此以SMRP表達(dá)水平來(lái)分析MPM早期診斷、評(píng)估進(jìn)展及預(yù)后需要更多樣本、更標(biāo)準(zhǔn)化的研究進(jìn)一步分析。

本研究以青石棉誘導(dǎo)大鼠MPM生成，首次采用MPM動(dòng)物模型進(jìn)行研究，對(duì)腫瘤不同分期、不同病理類型、不同分化程度的SMRP表達(dá)差異進(jìn)行系統(tǒng)研究。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，不同分期MPM的SMRP表達(dá)具有明顯差異，在T、N、M分期分別比較，SMRP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為SMRP表達(dá)可反映出腫瘤分期，進(jìn)一步證實(shí)可能參與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過(guò)程，可為早期診斷、靶向治療等提供理論依據(jù)。隨著腫瘤分期越高，SMRP表達(dá)量越高，通過(guò)檢測(cè)血清SMRP的表達(dá)，對(duì)有石棉暴露史的高危人群可進(jìn)行早期篩查、診斷，具有重要臨床價(jià)值。通過(guò)ROC曲線，得出SMRP早期診斷MPM的參考閾值，這是首次提出具體診斷MPM分期的量化指標(biāo)，具有重要臨床價(jià)值。分析SMRP表達(dá)與病理類型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同病理類型的MPM SMRP的表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SMRP表達(dá)與病理類型無(wú)關(guān)，這與之前研究的結(jié)果不同，推測(cè)可能原因是樣本量不足影響，還需要更多的研究來(lái)證實(shí)。此外分析不同分化程度的MPM SMRP表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低分化MPM的 SMRP表達(dá)高，分化程度代表腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，與正常胸膜細(xì)胞之間的差異越大，惡性程度也越高，說(shuō)明SMRP表達(dá)可間接反映MPM的惡性程度，同時(shí)也可能提示根據(jù)SMRP表達(dá)情況判斷預(yù)后具有可行性。但本研究是針對(duì)大鼠MPM，其研究結(jié)果尚不能用于人類MPM，下一步將對(duì)MPM患者血清中的SMRP表達(dá)進(jìn)行分析。

綜上所述，SMRP可反映腫瘤分期，根據(jù)血清SMRP表達(dá)量可判斷MPM分期，為具有石棉暴露史的高危人群早期篩查、診斷MPM提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。