白藜蘆醇對LPS刺激下RAW264.7細胞向破骨細胞分化的影響

劉子歌 張 晨 宋國瑞 李 燕 劉心蕊 陳德勝

EffectofResveratrolonDifferentiationofRAW264.7CellsintoOsteoclastsunderLPS.LiuZige,ZhangChen,SongGuorui,etal.SchoolofClinicalMedicine,NingxiaMedicalUniversity;BasicMedicalSchool,NingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceofMinistryofEducation,KeyLaboratoryofReproductionandGeneticsinNingxia;DepartmentofOrthopaedics,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Ningxia750004,China

AbstractObjectiveTo explore the effect pathway and mechanism of resveratrol on osteoclast formation in vitro stimulated by LPS.MethodsMouse RAW264.7 macrophages were cultured in 3 groups, blank group (Sham group); LPS group: blank group + LPS (1μg/ml); Res group: LPS group+resveratrol (10μmol/L). TRAP staining method was used to detect the number of mature osteoclasts in each group. ELISA method was used to detect the expression of TNF-α and IL-1β in the supernatant of each group.Q-PCR method was used to detect the expression of TNF-α and IL-1β mRNA in each group. Western blot method was used to detect the levels of phosphorylated proteins in nuclear transcription factor κBp65 (NF-κBp65) and IκBα in each group.ResultsTRAP staining: The number of osteoclasts positive for TRAP staining in the Res group was significantly reduced compared with the LPS group. ELISA detection: the expression levels of inflammatory factors in the LPS group were significantly higher than those in the Sham group (P<0.05),the expression of inflammatory factors in the Res group was significantly lower than that in the LPS group (P<0.05).Q-PCR detection: the expression levels of TNF-α and IL-1β mRNA in the LPS group were significantly higher than those in the Sham group (P<0.05), and the gene expression of TNF-α and IL-1β in the Res group was significantly inhibited (P<0.05).Western blot detection: the phosphorylation levels of IκBα and p65 in the Res group were significantly reduced compared to the LPS group (P<0.05).ConclusionResveratrol can down-regulate the expression of TNF-α and IL-1β in mouse RAW 264.7 macrophages stimulated by LPS through the NF-κB signalling pathway, and then affect the formation of osteoclasts. It is expected to be a key target for the treatment of inflammatory osteolysis caused by aseptic loosening.

KeywordsResveratrol; Nuclear factor kappa B signalling pathway; Osteoclasts; Aseptic loosening

人工關節置換術(total joint arthroplasty, TJA)被廣泛用于治療嚴重創傷、骨關節炎和類風濕關節炎等晚期關節疾病[1]。然而，據報道，由假體周圍骨溶解(peri-implant osteolysis, PIO)引起的無菌性松動是假體失敗的主要原因，導致超過1/3的患者在行TJA后的20年內還需接受翻修手術[2]。盡管翻修手術對于無菌性松動有治療作用，但是也不能忽視其費用較高、生存期較短和臨床效果較差等缺點。有研究證明，植入的假體在后續使用過程收到多種因素的綜合作用會不斷釋放超高分子聚乙烯、鈦、鈷和鉻等多種納米級磨損顆粒[3]。這些磨損顆粒會進一步刺激單核-吞噬細胞和成纖維細胞的聚集和吞噬，并釋放白細胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)等多種炎性細胞因子，他們可以促進炎性反應并誘導破骨細胞的形成和成熟。研究發現，在磨損顆粒刺激下的骨溶解小鼠模型中有內毒素積聚的現象，其中內毒素主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，因此骨溶解及骨吸收等可能與LPS密切相關[4]。

白藜蘆醇是一種天然植物產生的有多種益處的多酚，其中最受關注的是預防癌癥和神經保護。有研究報道，它還有一定的骨保護作用，在去卵巢的大鼠中，白藜蘆醇顯著改善了由雌激素缺乏引起的骨丟失[5]。在老齡小鼠中，長期喂食含白藜蘆醇的食物顯著延遲了老年性骨質疏松癥的發生[6]。多項研究表明，白藜蘆醇這種天然物質可能在治療或預防骨質疏松癥方面起作用。然而，白藜蘆醇能否有效抑制PIO目前尚不清楚。因為破骨細胞在PIO中起著關鍵作用，假設白藜蘆醇可以通過抑制破骨細胞的形成來防止骨丟失，從而減緩PIO。因此，本研究的目的是研究在體外試驗中白藜蘆醇對破骨細胞形成的影響，以及其在破骨細胞形成過程中可能的作用途徑和作用機制。

材料與方法

1.實驗材料:DMEM高糖培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；小鼠巨噬細胞株RAW264.7(中國科學院上海細胞庫)；LPS(美國Sigma-Aldrich公司)；白藜蘆醇(C14H12O3, 美國MCE公司)；TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物技術公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa生物公司)；β-actin抗體、p-NF-κBp65、p-IκBα(美國Cell Signalling公司)。

2.細胞培養及分組：按照Islam等[7]的方法建立體外炎性骨吸收細胞模型。將RAW264.7細胞種于含有10%胎牛血清的DMEM培養基，在5%CO2、37℃細胞培養箱培養。細胞共分為3組，即空白組 (Sham組)、LPS組[空白組+LPS(1μg/ml)]和Res組[對照組+白藜蘆醇(10μmol/L)]。本實驗所使用細胞均在10代以內。

3.實驗方法：(1)TRAP染色：將RAW264.7細胞以1×104個/孔接種于6 孔板，待細胞貼壁后按上述實驗方法分組處理，總共培養5天，每天換液。第5天后4%多聚甲醛固定細胞。按說明書配置TRAP染液，37℃生物培養箱中避光孵育1h，用堿性液沖洗干凈，晾干，光鏡下觀察并計數。(2)ELISA法檢測上清炎性因子表達：按照上述分組方法處理，收集第5天細胞培養的上清；800r/min離心5min，用以去除細胞，用ELISA試劑盒，檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β蛋白含量。(3)RNA提取及Q-PCR檢測：將RAW264.7細胞以1×104個細胞的密度接種在6孔板中，貼壁24h。然后，加入按照實驗分組的完全培養基。隔天換液。培養5天后，按照TRIzol試劑說明書規范提取總RNA。引物序列由上海生工設計和合成，詳見表1。反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，隨后放入反轉錄儀中進行反轉錄反應。(4)Western blot法檢測：各組細胞培養5天后，用細胞蛋白試劑盒提取各組細胞的蛋白，BCA蛋白定量試劑定量，配置12%分離膠溶液，50微克/孔加入蛋白勻漿，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，硝酸纖維素膜膜(NC)轉膜，5%BSA封閉1h后，一抗按1∶1500用TBST稀釋4℃封閉過夜。二抗按1∶10000用TBST稀釋室溫孵育2h。加入顯色液上機曝光。

表1 目標基因引物序列

結 果

1.白藜蘆醇能夠抑制LPS誘導體外破骨細胞的形成: TRAP是破骨細胞特異性的標志酶，TRAP染色是鑒定破骨細胞分化成熟的金標準，多核且 TRAP呈現陽性(酒紅色)的細胞便可鑒定為是破骨細胞。在對照組中可以觀察到較多體積較大、酒紅色、內含多個細胞核的破骨細胞。而Res組中應用白藜蘆醇干預后，染色呈陽性的破骨細胞數目明顯減少(圖1)。

圖1 TRAP染色下觀察各組細胞培養5天后破骨細胞的數量(TRAP，×200)A.Sham組；B.LPS組；C.Res組。紅色箭頭標識表示染色呈陽性的破骨細胞

2.白藜蘆醇能夠降低LPS刺激下小鼠RAW264.7巨噬細胞中炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的表達水平：用 ELISA試劑盒分別檢測3組細胞上清的炎性因子表達，評價白藜蘆醇的抗炎作用。白藜蘆醇對這兩種炎性細胞因子有顯著的抑制效果，Sham組、LPS組和Res組的TNF-α含量分別為24.78±2.06、555.32±17.23和 216.41±12.02pg/ml，IL-1β含量分別為40.55±1.84、223.05±5.94和71.40±3.42pg/ml。LPS組中各炎性細胞因子較Sham組顯著升高(P<0.05)，Res組較LPS組顯著降低 (P<0.05，圖2中A、B)。

圖2 白藜蘆醇對TNF-α與IL-1β的影響與Sham組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

3.白藜蘆醇下調TNF-α和IL-1β mRNA 的表達：Q-PCR實驗結果顯示，LPS組TNF-α和IL-1β mRNA的表達水平較Sham組明顯升高(P<0.05)；而相比LPS組的刺激, 在加入白藜蘆醇后，Res組中TNF-α、IL-1β的基因表達明顯被抑制(P<0.05，圖2中C、D)。

4.白藜蘆醇調控IκBα和p65蛋白的磷酸化影響NF-κB通路：Western blot法檢測結果顯示，Res組磷酸化的IκBα和p65的水平相對于LPS組有顯著的降低(P<0.05，圖3)。

圖3 Western blot法分析各組RAW264.7中IκBα和NF-κB p65蛋白磷酸化情況與Sham組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

討 論

人工全關節置換術是治療終末期關節疾病的有效方法[8]。然而，繼發于PIO的無菌性松動是人工關節置換術失敗的主要原因[9]。雖然確切的機制尚不清楚，但許多研究已經報道了破骨細胞在PIO的發展中起著重要的作用[10]。因此，破骨細胞被認為是治療溶骨性疾病的主要靶點。骨代謝內環境由破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成調控，在健康個體中，二者維持功能平衡，但當破骨細胞增多、功能亢進時就可能導致骨破壞疾病的發生。事實上，許多已知的靶向針對破骨細胞功能的藥物，如雙膦酸鹽，雷尼酸鍶和紅霉素，已經被證明可以抑制由磨損顆粒誘導的骨吸收作用[11～14]。然而，這些藥物的不良反應(發燒、胃潰瘍、頜骨骨壞死和不典型骨折)，以及它們受限的生物利用度的限制，限制了它們在PIO長期治療上的使用。因此，許多研究者將重點放在了對不良反應較小的天然化合物上。

白藜蘆醇最早在1924年被發現，其具有抗氧化、抗炎癥、抗衰老、肝保護和改善血脂異常的能力。有研究指出白藜蘆醇可以通過抑制軟骨細胞凋亡而起到預防骨關節炎的作用[15]。LPS是革蘭陰性桿菌外膜的主要組成成分，在骨組織中，它能夠通過促進 Connexin43蛋白與基因的表達，從而促進破骨細胞增多，從而增強骨吸收功能[16]。本研究采用LPS刺激下小鼠RAW264.7巨噬細胞模擬的炎性骨溶解模型，在細胞水平研究白藜蘆醇在破骨細胞形成過程中可能的作用途徑和作用機制。

破骨細胞從1873年被發現以來，關于其起源就一直存有廣泛的爭議。但是現在已經證明破骨細胞是一種終末細胞，與體內的成骨細胞同源，都是由巨噬細胞分化和自我融合而形成的[17]。本實驗中所采用的小鼠RAW264.7細胞與小鼠骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophage, BMM)普遍用于破骨細胞相關的體外實驗研究。而體外誘導RAW264.7細胞產生破骨細胞是一種比較成熟的體外培養破骨細胞的方法。相比BMM原代細胞的提取，RAW264.7具有細胞個體差異小、體外易于擴增、無需分離純化等方法提純和鑒定，更有利于對破骨細胞相關研究的開展。

炎性骨病中骨生長重建機制尚不明確，而通過研究LPS介導下的炎性骨病中破骨細胞的分化和活性調控機制，對于明確其規律具有重大意義，同時也能為感染性骨疾病的治療提供新方向。LPS所誘導的炎性骨溶解反應主要是通過刺激巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞及T淋巴細胞等分泌大量的TNF-α、IL-1β、和IL-6等炎性細胞因子引起。本研究的TRAP結果也顯示，Res組中破骨細胞數目與大小與LPS組比較顯著下降。研究表明，骨溶解與破骨細胞過度活動和骨吸收密切相關[18]。因此，探討破骨細胞與假體松動的關系具有重要的研究價值。炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等已被證實可以誘導破骨細胞前體細胞生成，進而加速人工關節假體周圍骨溶解，最終導致無菌性松動[19]。因此，調控炎性相關骨溶解效應在骨科研究中具有重要作用。白藜蘆醇可顯著降低在LPS刺激下的小鼠RAW264.7巨噬細胞中TNF-α和IL-1β 的表達，ELISA對細胞培養上清的檢測結果也證實了這一點。提示白藜蘆醇對LPS刺激下骨吸收的保護作用部分歸因于其抑制促炎性細胞因子的產生。

經典的NF-κB是一種異源二聚體，主要存在于細胞質中。它在炎癥過程中被激活，上調細胞因子的產生，以維持炎癥的級聯反應[20]。在TNF-α、LPS的刺激下，IκBα被磷酸化和降解，NF-κB二聚體釋放并移位到細胞核，通過與這些基因的啟動子結合來促進其靶基因的轉錄；NF-κB還可以被核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)通過與破骨細胞前體膜上的核因子-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)受體結合，從而促進破骨細胞的成熟、促進骨吸收。Franzoso等[21]早在1997年就研究證實，NF-κB p50/p52基因敲除小鼠不能產生成熟的破骨細胞。因此，阻斷NF-κB信號被認為是抑制破骨活性和減緩磨損顆粒誘導的骨溶解的有效方法。本研究通過Western blot法證實，白藜蘆醇通過減少IκBα和p65的磷酸化來抑制NF-κB的激活。

綜上所述，本研究證實白藜蘆醇有效地減輕了LPS誘導的小鼠RAW 264.7巨噬細胞炎癥骨吸收模型，這可能是通過調控NF-κB信號轉導通路來實現的。這些結果進一步支持了白藜蘆醇的骨保護作用，并為白藜蘆醇公認的抗炎和骨保護作用提供了新的機制見解。