大蒜素對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用

寧金卓，程帆，余偉民，李浩勇，饒婷，阮遠

(武漢大學人民醫院泌尿外科,武漢 430000)

腎缺血再灌注損傷(IRI)經常發生于失血性休克、腎移植、大血管手術等，可引起急性腎損傷，甚至急性腎衰竭[1]。雖然再灌注對于缺血性組織的存活是必不可少的，但有證據表明再灌注本身會引起細胞損傷，導致細胞最終死亡[2]。大蒜素是大蒜主要的生物活性成分，研究表明大蒜素有抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗高血壓、抗炎、抗凋亡和降脂等藥理作用[3-5]。大蒜素還被報道具有抗氧化和保護腦缺血性損傷的作用[6]。本研究旨在研究大蒜素對腎臟IRI實驗模型保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及器材 大蒜素,天津子涵生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；原位細胞凋亡檢測試劑盒，德國羅氏生物技術有限公司；免疫組織化學檢測試劑盒，上海研卉生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒及逆轉錄試劑盒,廣州威佳科技有限公司；Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C抗體，加拿大圣克魯斯公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組 40只健康雄性成年Wistar大鼠，體質量250～300 g，購于湖北省疾病預防控制中心,實驗獲武漢大學動物實驗倫理委員會批準。動物飼養于武漢大學人民醫院實驗動物中心,允許自由飲食和飲水。大鼠經腹腔注射2.0%苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，然后放置在恒溫設備上，保持直腸溫度為37～38 ℃。大鼠隨機分為以下4組,每組10只。(1)假手術組(A組)：暴露左側腎臟，僅游離左側腎蒂，不給予任何干預措施，暴露45 min 后縫合切口；(2)假手術+大蒜素組(B組)：A組基礎上腹腔注射50 mg/kg大蒜素進行干預；(3)腎臟IRI組(C組)：行腹部中線切口，用鈍性分離左側腎動脈和靜脈，用無創血管鉗夾閉左側腎蒂45 min，阻斷后可見被阻斷區腎葉顏色由鮮紅色變為暗紅色表明腎臟缺血成功，取下無創血管夾恢復腎臟血液供應，縫合切口關腹；(4)腎臟IRI+大蒜素組(D組)：C組基礎上,于再灌注同時腹腔注射50 mg/kg大蒜素進行干預。

1.2.2 腎臟病理 腎臟組織標本用0.9%氯化鈉注射溶液沖洗干凈后，置于4%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋,切片厚度4 μm，然后進行組織脫蠟、水化，用蘇木精和伊紅(HE)染色。

1.2.3 MDA和SOD測定 腎臟組織勻漿離心(3000 r/min,10 min)，收集上清液。用黃嘌呤氧化酶法測定SOD，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA，實驗重復3次。操作按照說明書進行。吸光度在532 nm處檢測MDA水平，單位為 nmol/g 蛋白。吸光度550 nm處測定SOD活性，單位為u/mg 蛋白。

1.2.4 腎小管上皮細胞凋亡 細胞凋亡檢測采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法，TUNEL陽性細胞顯示細胞核染成棕黃色。光鏡下(×200)每張切片選取10個視野，生精細胞的凋亡指數(AI)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.5 免疫組織染色 Bax和caspase-3的表達采用免疫組織化學染色分析。石蠟切片脫蠟至水并浸泡于蒸餾水中，高溫高壓修復后冷卻至室溫，轉入TBS緩沖液中，沖洗3次，每次5 min。3%過氧化氫室溫20 min阻斷內源性過氧化物酶，TBS沖洗3次，每次5 min。10%山羊血清孵育20 min，甩去血清，滴加一抗Bax，caspase-3后37 ℃孵育40 min。孵育完TBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加二抗，37 ℃孵育20 min，TBS沖洗3次，每次5 min。甩去TBS，采用Image-Pro Plus 6.0 進行免疫組織化學的圖片分析。

1.2.6 Western Blot檢測 剪碎腎臟組織勻漿裂解，4 °C下12 000 r/min離心5 min取上清。取20 μg樣品上樣電泳，隨后80 V電轉2 h至PVDF膜上。室溫下，5%脫脂牛奶搖床上封閉1 h，分別加1∶100稀釋的抗Cyt-C 抗體(sc13156;Santa Cruz,CA)和1∶200稀釋的抗Bcl-2抗體 (sc7382;Santa Cruz,CA)，在4 °C過夜進行抗體孵育。TBST洗膜3次，每次5 min，標記羊抗鼠二抗在室溫下孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，使用ECL試劑顯示蛋白條帶并拍照，使用Image J 成像分析軟件對結果進行半定量分析。

1.2.7 實時熒光定量(Real time-PCR)測定 采用Trizol法提取腎臟組織樣本總RNA，依操作說明取RNA 2 μg逆轉錄成cDNA。反應條件為：逆轉錄50 ℃ 15 min，95 ℃ 40 s；循環條件為：95 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，40個循環(預變性，變性，退火，延伸)。引物序列：Bax正義鏈5′TGAACTGGACAACAACATGGAG3′,反義鏈5′AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC3′；Bcl-2正義鏈5′TTTGATTTCTCCTGGCTGTCT3′，反義鏈5′CTGATTTGACCATTT GCCTG3′；caspase-3正義鏈5′-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3′，反義鏈5′-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3′；Cyt-C正義鏈5′-TTGACGGACCCCAAAAGATG-3′，反義鏈5′-AGAAGGTGCTCATGTCCTCA-3′；GAPDH正義鏈5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，反義鏈5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。實驗測定所得Ct值即為mRNA表達水平，用2-△△Ct法得出各組樣品mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 腎臟組織的病理學改變 A組和B組未見明顯的組織病理學改變，可見腎小管上皮細胞結構清晰，無明顯變性、壞死；C組可見腎小管擴張和充血,腎小管上皮細胞腫脹和壞死，部分管腔狹窄；與C組相比，D組可見腎小管上皮細胞損傷減輕，可見部分腫脹、變性,且管腔狹窄程度也較輕(圖1)。

2.2 腎臟組織中氧化應激水平 結果顯示，與A組和B組相比，C組中MDA含量顯著升高而SOD活性下降，差異有統計學意義(P<0.05)；另外，與C組相比，D組中MDA含量明顯下降而SOD活性顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 Wistar大鼠腎臟組織中MDA

2.3 腎小管上皮細胞凋亡情況 A組和B組中可見較少的、散在的腎小管上皮細胞凋亡；C組中凋亡細胞顯著增加，染色陽性細胞以遠端腎小管上皮細胞多見,與A組[AI：(4.24±0.85)%]和B組[AI：(4.28±0.82)%]相比，差異有統計學意義(P<0.05)；D組[AI：(12.25±1.27)%]細胞凋亡較C組[AI：(23.67±1.88)%]明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 腎臟組織中Bax和caspase-3免疫組織化學 Bax,caspase-3在A組和B組中僅可見腎小管上皮細胞散在的陽性表達；C組中陽性表達明顯增多，表現為細胞質和細胞核呈現為黃色或棕黃色；D組中陽性表達較C組明顯減少(圖2)。

圖2 Wistar大鼠腎臟組織中Bax和caspase-3免疫組織化學結果(×200)：A為假手術組；B為假手術+大蒜素組；C為腎臟IRI組；D為腎臟IRI組+大蒜素組

2.5 腎臟組織中Bcl-2和Cyt-C蛋白表達 Western Blot法檢測腎臟組織中Bcl-2和Cyt-C蛋白水平。結果顯示，與A和B組比較，C組中Cyt-C蛋白表達水平增加，而Bcl-2蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；另外，與C組相比，D組中Cyt-C蛋白含量顯著下降，Bcl-2蛋白表達水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 Wistar大鼠腎臟組織中Bcl-2和Cyt-C蛋白表達水平

2.6 腎臟組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表達 RT-PCR法檢測腎臟組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表達水平。結果可見，與A組和B組比較,C組中Bax、caspase-3和Cyt-C mRNA表達水平明顯增加，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與C組相比，D組中Bax、caspase-3和Cyt-C水平明顯下降，Bcl-2表達水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 Wistar大鼠腎臟組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表達水平

3 討論

腎臟受到手術、創傷、休克或其他損傷時，常引起腎臟IRI。血液供應重新建立，會導致活性氧的過度生成，可以改變細胞中蛋白質、脂質、核糖核酸的性質，造成細胞功能障礙甚至死亡[7]。而壞死的細胞引起炎癥級聯反應的激活，導致更嚴重的繼發性組織損傷[8]。針對腎臟IRI早期的治療具有重要意義。

大蒜素具有多種藥用功能，常用于治療多種疾病。Chen等[9]報道了大蒜素通過抑制氧化應激保護H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)凋亡；Kong等[6]研究發現大蒜素對缺血再灌注腦損傷的保護作用，可能與減少自由基和炎性因子的產生有關；研究認為氧化應激可通過缺血階段線粒體呼吸鏈的功能障礙而觸發，并在再灌注期被放大，導致直接損傷DNA、蛋白質、脂質而引起細胞損傷[10]。正常情況下，代謝過程中產生的活性氧可以被內源性抗氧化酶如SOD清除，過量的ROS生成和抗氧化能力的降低導致腎損傷加重[11]。MDA作為脂質氧化的重要產物。降低MDA水平和SOD活性的降低對心臟IRI具有保護作用[12]。本研究表明，大蒜素可明顯使IRI腎臟組織中的MDA含量降低，SOD活性升高，從而減輕腎臟氧化應激反應，增加抗氧化能力，減低腎臟組織學的損傷。

細胞凋亡在腎臟IRI的病理過程中有重要的作用[13]。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，能抑制脂質過氧化物的形成及內質網Ca2+釋放和自由基的產生[14]。Bax是Bcl-2的內源性拮抗劑，促進細胞凋亡[15]。在生理狀態下，Bcl-2和Bax的表達保持平衡。缺血再灌注通過增加Bax蛋白表達水平和降低Bcl-2蛋白水平來激活細胞凋亡[16]。caspase的激活是細胞凋亡的另外一個顯著特征，其參與哺乳動物細胞凋亡細胞程序的啟動和執行[17]。caspase-3由32 kDa酶原形成，通過凋亡配體和線粒體途徑裂解為活性17 kDa亞基，這是一種關鍵的效應因子caspase，它在細胞凋亡的最后階段開始降解細胞[18]。過量的ROS同時激活線粒體和內質網應激通路，當線粒體受損時，Bax的增加和Bcl-2的減少改變了線粒體外膜中Bax和Bcl-2的比例，促進細胞色素C(Cyt-C)的釋放；Cyt-C激活凋亡效應蛋白caspase-3，最終誘導線粒體依賴性細胞凋亡[19]。本研究表明，IRI組中,細胞凋亡明顯增高；經大蒜素干預后，細胞凋亡較IRI組明顯降低；大蒜素在腎臟IRI中發揮了抗凋亡的作用。

總之，本研究證明大蒜素對大鼠腎臟IRI具有抗凋亡和抗氧化作用。但大蒜素對損傷的腎臟有保護作用的具體機制有待進一步闡明。