LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p對IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡的機制研究

郭秀珍 高斌禮* 郭文 劉慶梁 馮睿 吳燕珍

1.內蒙古醫科大學附屬醫院， 內蒙古 呼和浩特 010050 2.包頭醫學院第二附屬醫院， 內蒙古 包頭 014010 3.內蒙古包鋼醫院， 內蒙古 包頭 014010

骨關節炎(osteoarthristis，OA)是臨床常見的一種慢性退變性關節疾病，其主要病理特征為關節軟骨發生退行性病變，而關節軟骨由軟骨細胞與細胞外基質構成[1]。研究[2-3]表明IL-6、TNF-α、IL-8等炎性因子分泌量增加可促進炎癥反應的發生，從而促進OA進展。因而抑制炎癥反應可減少OA中軟骨退變，從而減緩疾病進展。白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可影響關節軟骨細胞基質合成，從而參與OA發生及發展過程。研究[4]表明，IL-1β可作為體外研究中OA的誘導劑。LncRNA FGD5-AS1在牙周炎中呈低表達，過表達可抑制牙周炎的發展[5]。生物信息學分析顯示miR-103a-3p可能是FGD5-AS1的靶基因，研究[6]表明miR-103a-3p在類風濕關節炎患者血清中表達上調。但FGD5-AS1是否可靶向調控miR-103a-3p參與骨關節炎發生發展過程尚未可知。研究[7]表明，抑制NF-κB信號通路的激活可有效抑制機體內炎癥反應。本研究采用IL-1β誘導大鼠關節軟骨細胞模擬OA環境，檢測細胞中FGD5-AS1與miR-103a-3p的表達水平，探究其對關節軟骨細胞炎癥損傷及細胞凋亡的影響及作用機制，為進一步揭示OA發生與發展的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠關節軟骨細胞(寧波明舟生物科技有限公司)；DMEM與胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(上海鈺博生物科技有限公司)；IL-1β(美國Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；pcDNA3.1(上海遠慕生物科技有限公司)；miR-103a-3p mimics及陰性對照(miR-NC)、si-FGD5-AS1及si-NC(上海吉瑪制藥技術有限公司)；Trizol試劑、反轉錄與熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；IL-6、TNF-α、IL-8 ELISA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(上海朗智生物科技有限公司)；兔抗鼠Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3抗體(美國CST公司)；兔抗鼠p-NF-κB p65、p-IκBα抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組：將軟骨細胞分為NC組(未進行處理的軟骨細胞)、IL-1β組(濃度為10 ng/mL的IL-1β處理軟骨細胞)[8]。分別將pcDNA、pcDNA-FGD5-AS1、pcDNA-FGD5-AS1與miR-NC、pcDNA-FGD5-AS1與miR-103a-3p mimics轉染至軟骨細胞，在含有10 ng/mL 的IL-1β培養基內培養48 h。

1.2.2ELISA檢測IL-6、TNF-α、IL-8濃度：收集各組細胞培養上清液，4 ℃條件下經1 300 r/min轉速離心10 min，吸取上清，參照ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞中FGD5-AS1、miR-103a-3p的表達水平：采用Trizol法提取各組細胞中總RNA，應用Nanodrop 2000c超微量分光光度計測定RNA濃度，參照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環40次。FGD5-AS1以GAPDH為內參，miR-103a-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算FGD5-AS1、miR-103a-3p的相對表達量。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率：收集各組對數期軟骨細胞，預冷PBS洗滌，加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，充分混勻后，室溫避光孵育10 min，置于FACS Calibur流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡。

1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測FGD5-AS1的靶基因：靶基因預測軟件starbase預測顯示FGD5-AS1與miR-103a-3p存在結合位點，利用基因突變技術將結合位點進行突變，分別將結合位點與突變位點插入熒光素酶報告基因載體分別構建野生型載體WT-FGD5-AS1與突變型載體MUT-FGD5-AS1，分別將WT-FGD5-AS1、MUT-FGD5-AS1與miR-NC、miR-103a-3p mimics共轉染至軟骨細胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組相對熒光素酶活性。

1.2.6Western blot檢測Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達：收集各組對數生長期軟骨細胞，加入RIPA裂解液后經1 000 r/min轉速離心15 min(4 ℃)，吸取上清液(總蛋白)。采用BCA檢測蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE反應，將電泳產物轉移至PVDF膜，封閉2 h，加入蛋白一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL顯影，應用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

圖1 FGD5-AS1過表達對IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡的影響 A：流式細胞術檢測細胞凋亡率；B：細胞凋亡相關蛋白免疫印跡圖。Fig.1 Effect of FGD5-AS1 overexpression on the apoptosis of articular chondrocytes induced by IL-1β

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 IL-1β誘導的關節軟骨細胞中LncRNA FGD5-AS1與miR-103a-3p的表達量

實驗結果顯示，與NC組相比，IL-1β組軟骨細胞中FGD5-AS1的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-103a-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 IL-1β誘導的關節軟骨細胞中LncRNA FGD5-AS1與miR-103a-3p的表達量

2.2 FGD5-AS1過表達對IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥損傷的影響

與NC組相比，IL-1β組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 FGD5-AS1過表達對IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥損傷的影響

2.3 FGD5-AS1過表達對IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡的影響

與NC組相比，IL-1β組關節軟骨細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1組關節軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，見圖1、表3。

表3 FGD5-AS1過表達對IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡的影響

2.4 FGD5-AS1靶向調控miR-103a-3p的表達

starBase預測顯示LncRNA FGD5-AS1 與miR-103a-3p存在結合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，轉染野生型載體WT-FGD5-AS1的細胞中，miR-103a-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；轉染突變型載體MUT-FGD5-AS1的細胞中，miR-103a-3p組熒光素酶活性相較于miR-NC組差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。qRT-PCR檢測結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-FGD5-AS1組miR-103a-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-FGD5-AS1組miR-103a-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)，見表5。

圖2 FGD5-AS1的序列中含有與miR-103a-3p互補的核苷酸序列Fig.2 The sequence of FGD5-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-103a-3p

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 FGD5-AS1負向調控miR-103a-3p的表達

2.5 FGD5-AS1調控miR-103a-3p影響關節軟骨細胞炎癥損傷及細胞凋亡

與IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-103a-3p組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，見圖3、表6、表7。

表6 FGD5-AS1調控miR-103a-3p影響關節軟骨細胞炎癥損傷Table 6 FGD5-AS1 regulates miR-103a-3p to affect articular chondrocyte inflammation and

表7 細胞凋亡相關蛋白相對表達量

圖3 細胞凋亡相關蛋白免疫印跡圖Fig.3 Western blot of apoptosis-related proteins

2.6 FGD5-AS1靶向miR-103a-3p調控NF-κB信號通路

實驗結果顯示，與IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1組p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-103a-3p組p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，見圖4、表8。

圖4 NF-κB信號通路相關蛋白免疫印跡圖Fig.4 Western blot of NF-κB signaling pathway related proteins

表8 NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量

3 討論

FGD5-AS1在急性心肌梗死患者中表達下調，并可能參與急性心肌梗死發生及發展過程[9]。研究[10]表明,FGD5-AS1可促進結直腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲。本研究結果顯示，FGD5-AS1在IL-1β誘導的關節軟骨細胞中表達下調，提示FGD5-AS1表達量降低可能促進OA的發生及發展。同時還顯示IL-1β誘導的關節軟骨細胞中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平升高，與相關文獻報道相似[11]，提示IL-1β可明顯造成軟骨細胞炎癥損傷。進一步研究結果顯示，FGD5-AS1過表達后炎性因子水平明顯降低，提示FGD5-AS1過表達可通過降低炎性因子水平而減輕IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥損傷。相關報道[12]指出細胞氧化應激損傷可促進凋亡蛋白Bax表達，Bax表達上調可促進線粒體釋放Cyt C進而激活Caspase級聯反應最終誘導細胞凋亡。本研究結果顯示IL-1β處理后關節軟骨細胞凋亡率明顯升高，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高，而FGD5-AS1過表達后可明顯抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡，提示FGD5-AS1過表達可能通過調控線粒體途徑而抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡。

miR-103a-3p表達量升高可能與骨骼疾病發生過程有關[13]。研究[14]表明miR-103a-3p可促進血管緊張素II誘導的腎臟炎癥及纖維化的發生。本研究通過雙熒光素酶報告實驗結果證實FGD5-AS1靶向負調控miR-103a-3p的表達，進一步研究顯示miR-103a-3p過表達后可明顯逆轉FGD5-AS1過表達對IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥損傷及細胞凋亡的作用，提示FGD5-AS1過表達可通過下調miR-103a-3p表達從而減輕IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥損傷，抑制細胞凋亡。相關報道[15]指出p65是NF-κB信號通路主要蛋白，正常生理狀態下NF-κB與IκB結合，若細胞受到刺激后IκB降解后可釋放NF-κB p65進而促進關節軟骨細胞炎癥損傷。本研究結果顯示FGD5-AS1過表達后可明顯降低p-NF-κB p65、p-IκBα表達，而miR-103a-3p過表達后可明顯促進p-NF-κB p65、p-IκBα表達，提示FGD5-AS1過表達可能通過靶向抑制miR-103a-3p表達而抑制NF-κB信號通路激活從而減輕IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥損傷，抑制細胞凋亡，對軟骨細胞發揮保護作用。

綜上所述，FGD5-AS1過表達靶向抑制miR-103a-3p表達可抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞炎癥反應及細胞凋亡，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路的活化有關，可為深入探討FGD5-AS1對關節軟骨細胞凋亡及炎癥的影響及分子機制奠定理論基礎，有助于闡明OA發病機制及防治OA。