miR-92a-3p靶向EZH2對IL-1β誘導軟骨細胞合成基質降解酶的影響

張明煥 毛文 劉雷 祁福 李北 鄭一舟

湖北省武漢市第三醫院骨科，湖北 武漢 430071

骨關節炎是一種嚴重影響人類生活質量的退行性疾病，其以關節基質破壞為特點[1]。研究[2]表明，致炎因子白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導的軟骨細胞損傷是骨關節炎發生的重要原因之一。miRNA是存在于人體中的重要調節因子，其幾乎在人類的所有組織和器官中均有表達，參與細胞生長、胚胎發育等生理過程[3]。研究[4]顯示，miRNA異常表達與疾病的發生和進展有關，人為的靶向調控miRNA的表達可能是有效防治疾病的重要手段。miR-92a-3p作為miRNA成員，參與影響多種細胞的生理和病理轉化過程，比如腫瘤、心血管系統疾病、紅斑狼瘡等疾病的發生[5-7]。以往研究[8]證實，miR-92a-3p在骨關節炎軟骨組織中表達下調。miRNA發揮生物學作用與靶向影響下游基因的表達有關。我們預實驗顯示zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)與miR-92a-3p可能互為靶向關系。EZH2是一個在骨關節炎中表達水平異常升高的調控基因，影響軟骨細胞基質降解酶合成[9]?，F階段對于miR-92a-3p在骨關節炎軟骨細胞合成基質降解酶中的作用還不明確。本研究以人骨關節軟骨細胞為研究對象，用誘導因子IL-1β體外構建骨關節炎軟骨細胞模型，探討miR-92a-3p對骨關節炎軟骨細胞合成基質降解酶的影響和機制，以期為靶向基因治療骨關節炎提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

收集湖北省武漢市第三醫院髖關節置換術(非骨關節炎患者)中切除的關節軟骨組織共5例，標本采集經過患者和家屬知情同意。pCDNA3.1和pCDNA3.1-EZH2由湖南普拉特澤生物科技有限公司構建；COLⅡ抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；MicroRNA Reverse Transcription Kit購自美國Thermo；miR-92a-3p mimics、mimics control由南京博恩生物技術有限公司構建合成；MMP-13抗體、MMP-1抗體購自美國Abcam；引物由北京優博蘭基因技術有限公司合成；EZH2抗體購自艾美捷科技有限公司。

1.2 人關節軟骨細胞分離培養

采用單層細胞培養方法分離培養人關節軟骨細胞，步驟參照文獻[10]，取軟骨組織，浸泡到PBS溶液中，然后添加2.5 g/L的胰蛋白酶消化約15 min。將關節軟骨周圍的多余組織去除，然后用PBS再次洗滌，剪碎成1 mm3的組織塊，添加消化液(含有20%血清、0.2% Ⅱ型膠原酶)，消化20 h以后，收集細胞懸浮液，以150目的濾網將細胞過濾，1 500g離心10 min。添加含有10%胎牛血清的DMEM/F12細胞培養液將細胞懸浮，接種到細胞培養板中，在37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h，2 d后換液。細胞經過Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定為軟骨細胞。

1.3 RT-PCR檢測IL-1β處理對軟骨細胞中miR-92a-3p表達影響

收集軟骨細胞，用含IL-1β濃度為0、10 ng/mL的細胞培養液培養，記為Normal、IL-1β組，48 h以后收集細胞用RT-PCR方法檢測。步驟為：用試劑盒提取細胞中的RNA(Trizol法)，使用特異性的頸環引物反轉錄合成cDNA，cDNA合成用MicroRNA Reverse Transcription Kit。用SYBR Premix EX Taq進行RT-PCR檢測，內參為U6。根據反應的Ct值對miR-92a-3p表達水平進行定量，計算方法為2-△△Ct法。PCR反應程序為：95 ℃ 20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，一共40個循環。引物序列為：U6- Sense：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，Antisense：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-92a-3p-Sense：5’-GGGGCAGTTATTGCACTTGTC-3’，Antisense：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’。

1.4 細胞轉染和過表達效果檢測

在人軟骨細胞中轉染miR-92a-3p mimics和mimics control，轉染步驟參照轉染試劑Lipofectamine 2000，將轉染以后的細胞用含有IL-1β濃度為10 ng/mL的細胞培養液培養，記為miR-92a-3p+IL-1β和miR-NC+IL-1β組，把沒有轉染的軟骨細胞用含有IL-1β濃度為10 ng/mL的細胞培養液培養記為IL-1β組。細胞培養48 h以后，用RT-PCR方法測定細胞中miR-92a-3p表達變化，步驟同上。

1.5 Western blot檢測MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達

收集培養48 h以后的Normal、IL-1β、miR-NC+IL-1β、miR-92a-3p+IL-1β組細胞，添加RIPA蛋白裂解試劑，放在冰上裂解，細胞刮刀將細胞收集并轉移至離心管中，10 000g離心15 min，吸取上清，Bradford法檢測蛋白濃度。蛋白樣品中添加等體積的上樣緩沖液，置于100 ℃中孵育5 min。本研究用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳，在濃縮膠中采用90 V電壓電泳，在分離膠中采用120 V電壓電泳，蛋白上樣量為40 μg。觀察溴酚藍染料電泳到凝膠的底部以后，進行轉膜。取PVDF膜，設置60 V電壓將蛋白從分離膠轉移到PVDF膜上。PVDF膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h；然后將PVDF膜放在TBST中洗滌3次，再置于1∶800稀釋以后的一抗溶液中充分結合；再次用TBST洗滌3次，最后把PVDF膜放在1∶2 000稀釋的二抗溶液中充分結合。抗體以封閉液稀釋。按照ECL方法顯色。內參為β-actin。根據條帶的吸光度值分析目的蛋白表達變化。

1.6 miR-92a-3p靶基因預測和鑒定

Targetscan在線靶基因預測軟件發現EZH2可能為miR-92a-3p的靶基因，EZH2的3，UTR端存在與miR-92a-3p結合位點。分別構建野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告載體(由上海正茂生物科技有限公司構建)。將WT、MUT分別同miR-92a-3p mimics和mimics control共轉染到軟骨細胞中，繼續培養48 h以后，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定熒光素酶變化。同時收集培養48 h以后的Normal、IL-1β、miR-NC+IL-1β、miR-92a-3p+IL-1β組細胞，用Western blot方法測定EZH2蛋白表達變化，步驟同上。

1.7 檢測pCDNA3.1-EZH2對過表達miR-92a-3p影響細胞MMP-13、MMP-1、COLⅡ表達的作用

將miR-92a-3p mimics、pCDNA3.1和miR-92a-3p mimics、pCDNA3.1-EZH2分別共轉染到軟骨細胞中，并用含有IL-1β濃度為10 ng/mL的細胞培養液培養，記為miR-92a-3p+ pCDNA3.1+IL-1β、miR-92a-3p+ pCDNA3.1-EZH2+IL-1β組，細胞培養48 h以后，用Western blot方法檢測細胞中EZH2蛋白表達變化，步驟同上。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 IL-1β對軟骨細胞中miR-92a-3p表達影響

如表1，IL-1β處理以后的軟骨細胞中miR-92a-3p表達水平明顯下降(P<0.05)。IL-1β可以抑制軟骨細胞中miR-92a-3p表達。

圖1 Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定軟骨細胞Fig.1 Identification of chondrocytes with col II immunohistochemistry

表1 IL-1β處理后軟骨細胞中miR-92a-3p表達水平

2.2 miR-92a-3p mimics對IL-1β條件下軟骨細胞中miR-92a-3p表達影響

如表2，miR-92a-3p mimics轉染后的軟骨細胞經過IL-1β誘導處理以后，細胞中的miR-92a-3p表達水平明顯升高(P<0.05)。miR-92a-3p mimics提高IL-1β條件下軟骨細胞中miR-92a-3p表達水平。

表2 miR-92a-3p mimics轉染后經IL-1β處理的軟骨細胞中miR-92a-3p表達水平

2.3 過表達miR-92a-3p對IL-1β條件下軟骨細胞MMP-13、MMP-1、COLⅡ表達影響

如圖2和表3，IL-1β處理以后的軟骨細胞中MMP-13、MMP-1表達水平升高，COLⅡ表達水平下降(P<0.05)；miR-92a-3p mimics轉染可以明顯減少IL-1β條件下軟骨細胞中MMP-13、MMP-1蛋白表達并促進細胞中COLⅡ蛋白表達(P<0.05)。

圖2 Western blot法檢測miR-92a-3p mimics轉染后經IL-1β處理的軟骨細胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達變化Fig.2 Protein expressions of MMP-13, MMP-1, and col Ⅱ in chondrocytes with the condition of IL-1β after transfection of miR-92a-3p mimics

表3 miR-92a-3p mimics轉染后經IL-1β處理的軟骨細胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達水平

2.4 miR-92a-3p靶向關系預測和鑒定

如圖3和表4，在線靶基因預測軟件發現EZH2的3’UTR端與miR-92a-3p有堿基互補結合位點，并且EZH2-WT轉染可以降低細胞熒光素酶活性。miR-92a-3p和EZH2互為靶向關系。

2.5 過表達miR-92a-3p對IL-1β條件下軟骨細胞EZH2表達影響

如圖4和表5，IL-1β處理以后的軟骨細胞中EZH2表達水平升高(P<0.05)；miR-92a-3p mimics轉染可以明顯減少IL-1β條件下關節軟骨細胞中EZH2蛋白表達(P<0.05)。miR-92a-3p靶向負調控EZH2。

圖3 在線靶基因預測結果示意圖Fig.3 Illustrating chart of on-line target gene prediction

表4 細胞熒光素酶活性Table 4 Activity of luciferase report

圖4 Western blot法檢測miR-92a-3p mimics轉染后經IL-1β處理的軟骨細胞中EZH2蛋白表達變化Fig.4 Protein expression of EZH2 in chondrocytes with the condition of IL-1β after transfection of miR-92a-3p mimics

2.6 pCDNA3.1-EZH2對過表達miR-92a-3p影響軟骨細胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ、EZH2蛋白表達的作用

如圖5和表6，與pCDNA3.1、miR-92a-3p mimics共轉染比較，pCDNA3.1-EZH2、miR-92a-3p mimics共轉染可以提高IL-1β條件下軟骨細胞中MMP-13、MMP-1、EZH2蛋白表達水平，減少細胞中COLⅡ蛋白表達水平(P<0.05)。pCDNA3.1-EZH2可以逆轉過表達miR-92a-3p對關節軟骨細胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達的影響。

表5 miR-92a-3p mimics轉染后經IL-1β處理的軟骨細胞中EZH2蛋白表達水平

圖5 Western blot法檢測miR-92a-3p mimics和pCDNA3.1-EZH2共轉染后經IL-1β處理的軟骨細胞中EZH2蛋白表達變化Fig.5 Protein expression of EZH2 in chondrocytes with the condition of IL-1β after co- transfection of miR-92a-3p mimics and pCDNA3.1-EZH2

表6 miR-92a-3p mimics和pCDNA3.1-EZH2共轉染后經IL-1β處理的軟骨細胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ、EZH2蛋白表達水平

3 討論

IL-1β是一個促炎因子，其是骨關節炎發生的重要誘因。IL-1β可以誘導關節軟骨細胞合成基質降解酶，加快細胞外基質降解[11]。正常情況下，骨關節軟骨組織中存在的膠原蛋白可以起到保護關節的作用，而骨關節炎發生時，膠原蛋白被降解，造成軟骨組織破壞[12]。COLⅡ是一種膠原蛋白，其在骨關節炎發生時水平明顯下降[13]。MMPs是一類可以降解細胞外基質的蛋白酶，其含有多個成員，在人體不同的組織中表達，軟骨細胞合成的MMPs能夠將細胞外基質降解，破壞結締組織，導致骨關節炎的發生[14]。研究顯示，MMP-13和MMP-1均是MMPs家族中與骨關節炎關系最為密切的蛋白成員，其表達水平越高，骨關節炎的嚴重程度越高[15]。我們的實驗結果表明，IL-1β處理以后的軟骨細胞中MMP-13和MMP-1表達水平升高，而COLⅡ表達水平降低，提示成功構建了骨關節炎軟骨細胞體外模型。

miRNA是一類缺乏開放閱讀框的小分子RNA，其不具備編碼蛋白質的功能。miRNA在人體多種組織中表達，參與不同的生理過程，在細胞分化、能量代謝、神經發育等過程中發揮作用[16]。研究表明，miRNA與疾病發生有關，在疾病進展中發揮促進或抑制作用。miR-92a-3p在人體中廣泛表達，與腫瘤、冠心病等有關[5,17]。研究報道顯示，miR-92a-3p參與調控關節軟骨的發育以及穩態維持過程，并且miR-92a-3p可能與骨關節炎的發生有關，其在骨關節炎中表達下調[8]。我們的研究結果表明，IL-1β處理后的關節軟骨細胞中miR-92a-3p表達水平下降，過表達miR-92a-3p可以明顯抑制IL-1β誘導的軟骨細胞合成MMP-13和MMP-1，同時促進COLⅡ表達，這提示miR-92a-3p能夠減少骨關節炎軟骨細胞合成基質降解酶，miR-92a-3p在骨關節炎發生過程中可能發揮保護作用。

miRNA作用多樣，其作用機制也十分復雜，miRNA通過影響下游基因的表達和信號轉導發揮生物學作用[18-19]。研究表明，miRNA靶基因調控是miRNA功能發揮的重要原因之一，并且同一個miRNA在不同的組織或生理進程中可能同時存在多個靶基因[20]。本研究表明，miR-92a-3p可以靶向調控軟骨細胞中EZH2的表達。EZH2基因定位在7q35染色體上，其含有多個功能結構域，具有染色體修飾功能[21-22]。EZH2參與骨關節炎進展，在人關節炎軟骨組織中表達上調，而抑制EZH2可以減少關節炎軟骨細胞合成基質降解酶，EZH2抑制劑可以減緩小鼠骨關節炎進展[9]。我們的研究表明，EZH2可以逆轉miR-92a-3p對骨關節炎軟骨細胞合成MMP-13、MMP-1和COLⅡ的影響，提示miR-92a-3p作用機制與靶向影響EZH2表達有關。

總之，miR-92a-3p在骨關節炎進展中可能發揮抑制作用，其在IL-1β誘導的軟骨細胞中表達下調，過表達miR-92a-3p可以減少軟骨細胞合成MMP-13、MMP-1并促進細胞合成COLⅡ，作用機制與靶向負調控EZH2有關。以后會繼續研究miR-92a-3p在骨關節炎軟骨細胞基質降解酶合成中的下游網絡調控機制。本研究果為研究骨關節炎發生機制提供了參考，為靶向基因治療骨關節炎提供了方向。