復方苦參灌腸劑急性毒性及直腸黏膜刺激實驗研究*

朱 鳳，楚 思，吳 慧，劉與進，范 恒

（華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中西醫結合科，武漢 430022）

潰瘍性結腸炎是一種病因未明的結腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層，臨床以腹痛及排便異常為特征[1-2]，本病纏綿難愈，嚴重影響患者身心健康[3]，其西藥治療效果有限，且長期治療多伴有嚴重不良反應。復方苦參灌腸劑是由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中醫科研制的能有效治療潰瘍性結腸炎的驗方，此中藥復方具有清熱燥濕、生肌止血、涼血解毒功效，中藥結合西藥治療潰瘍性結腸炎，其臨床效果明顯優于單純西藥治療[4-5]，且顯著提高患者生活質量。雖然多數中藥、天然藥物作用相對溫和，毒性輕，但是近年來隨著對中藥及其制劑的廣泛應用和對毒性研究的不斷深入，發現一些補益的中藥和許多普遍認為“無毒”的中藥也存在一定的毒副作用[6]。本研究依據《中藥、天然藥物急性毒性研究指導原則》的要求[7]，探討了復方苦參灌腸劑灌腸給藥對小鼠的急性毒性以及對大鼠多次直腸給藥后的刺激反應，結果報道如下。

1 實驗藥物

1.1 急性毒性實驗 復方苦參灌腸劑濃縮液：由湖北省中醫院藥劑科提供，批號：20181022。復方苦參灌腸劑：苦參600 g，地榆炭600 g，白及400 g，青黛200 g，甘草 300 g，三七粉 100 g，仙鶴草 300 g，薏苡仁 600 g，黃柏 400 g，黃連 400 g，秦皮 400 g，白頭翁300 g，煎煮2次，濃縮至3 290 mL，無菌分裝14瓶，藥物濃度約為1.40 g/mL，成人每日用量為230 g生藥/60 kg，其中隨機選取1瓶用生理鹽水稀釋兩倍，濃度為0.7 g/mL。

1.2 直腸黏膜刺激實驗 復方苦參灌腸劑由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥劑科提供，批號：20181022。苦參 30 g，地榆炭 30 g，白及 20 g，青黛 10 g，甘草 15 g，三七 5 g，仙鶴草 15 g，薏苡仁30 g，黃柏 20 g，黃連 20 g，秦皮 20 g，白頭翁 15 g，濃縮至150 mL，每日劑量為230 g生藥/60 kg。

2 實驗動物

2.1 急性毒性實驗 SPF級昆明小鼠60只，體質量18～22 g，雌雄各半，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，合格證編號為SCXK（鄂）2016-0009。飼養于華中科技大學實驗動物中心，室溫：（22±3）℃，相對濕度：55%～60%，無對流風，人工晝夜（12 h白晝、12 h黑夜）。適應性喂養1周后開始實驗。

2.2 直腸黏膜刺激實驗 SPF級SD大鼠20只，體質量150～200 g，雌雄各半，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，合格證編號為SCXK（鄂）2016-0009。

3 實驗方法

3.1 急性毒性實驗 因復方苦參灌腸劑毒性低，動物灌腸給藥受藥物濃度和體積限制，測不出半數致死量（LD50），故進行最大給藥量實驗。取4～5周18～22 g SPF級昆明小鼠40只，其中雌雄小鼠均各隨機分為2組，每組10只，將4組小鼠不同性別之間隨機匹配分為2組，每組20只，雌雄各半，分為正常對照組和實驗組。正常對照組予以生理鹽水灌腸，實驗組予以0.7 g/mL復方苦參灌腸劑灌腸，灌腸體積為0.04 mL/g。

3.2 直腸黏膜刺激實驗 依據參考文獻[8]，SPF級SD大鼠20只，其中雌雄大鼠均各隨機分為2組，每組5只，將4組小鼠不同性別之間隨機匹配分為2組，每組10只，雌雄各半，分為正常對照組和實驗組。實驗組以臨床用藥量、臨床給藥途徑相同的方式，按體表面積等效劑量換算成給藥劑量，大鼠每日給藥11.0 g生藥/kg（大鼠）。正常對照組予以等量生理鹽水灌腸。給藥前予以10%水合氯醛將大鼠麻醉，實驗前禁食不禁水4 h，給藥后2 h結束禁食，每日給藥1次，連續給藥7 d。

4 觀察指標

4.1 急性毒性實驗 給藥前動物禁食不禁水12 h，實驗當天24 h內分別灌腸給予濃度為0.7 g/mL的復方苦參灌腸劑和生理鹽水，按0.04 mL/g體積灌腸兩次，灌腸前進行麻醉處理，灌腸完成后用棉花為小鼠保暖。觀察并記錄給藥后30 min、2 h及隨后14 d小鼠外觀、行為、飲食、排泄物及毒性反應，每日稱體質量；記錄14 d內死亡小鼠數，死亡小鼠立即解剖，觀察其內臟病理變化，若有肉眼可觀察到的異常變化則進行病理檢查。所有小鼠實驗第15天脫頸處死，解剖觀察心、肝、脾、肺、腎、結腸病理變化，每組各取雌雄1只，內臟組織標本經甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察藥物對各臟器的影響。

4.2 直腸黏膜刺激實驗 每日觀察大鼠毒性反應情況，詳細記錄癥狀出現、加重、減輕或死亡的時間和出現反應的動物數量，計算動物病死率。給藥后24 h時每組處死1只大鼠，解剖觀察直腸黏膜充血、水腫情況，按照表1評分判斷刺激性，并行病理學檢查。第8天每組解剖5只動物，剩余4只動物停藥繼續觀察1周。同樣肉眼觀察解剖動物直腸黏膜有無充血、紅腫等現象。按照表1以積分評價方法判斷藥物對直腸黏膜是否有刺激性，并進行組織病理學檢查。如果病理檢查結果有異常，則停藥觀察的大鼠需做組織病理學檢查；如果檢查結果無異常，則停藥觀察的動物只需行解剖肉眼觀察。

表1 局部黏膜刺激及反應評分標準

5 統計學方法

6 實驗結果

6.1 急性毒性實驗結果

6.1.1 各組小鼠病死率及一般情況變化 14 d內各組小鼠病死率及臨床變化如下：實驗組及正常對照組小鼠在兩次灌腸30 min內，由于處于麻醉狀態出現倦怠懶動、飲食減少，毛發、排泄物均正常，2 h后恢復反應靈敏，活動自如，飲食正常，口鼻無異常分泌物，連續觀察14 d，動物一般情況良好，活動自如，皮毛光滑，飲食及二便未見明顯異常；無死亡小鼠，實驗結束處死所有小鼠，解剖肉眼觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎、結腸等主要臟器未見明顯異常。見表2。

6.1.2 各組小鼠體質量變化 灌腸給藥復方苦參灌腸劑后，連續觀察14 d小鼠體質量變化情況。實驗表明，給藥后，兩組小鼠在給藥后體質量均較前增加，給藥后實驗組體質量增長與正常對照組比較無統計學差異（P＞0.05）。見表3。

表2 復方苦參灌腸劑急性毒性實驗對小鼠死亡情況的影響

6.1.3 各組小鼠內臟組織病理學變化 兩組小鼠心、肝、脾、肺、腎及結腸組織標本HE染色結果見圖1。正常對照組與實驗組的心、肝、脾、肺、腎及結腸組織均無明顯病理改變。各組心臟組織心肌細胞排列有序，細胞著色未見異常，肝組織細胞排列緊密，細胞形態良好，肝小葉結構完整；肺組織肺泡結構清晰，間隔正常，管壁結構良好；脾組織淋巴細胞排列緊密，無淤血和點狀壞死；腎組織結構清晰，腎小球正常；腸黏膜完整，黏膜下層腺體排列完好，可散見杯狀細胞，各組各個臟器無明顯炎性細胞浸出、纖維化和壞死等病理變化。

6.2 直腸黏膜刺激實驗結果

6.2.1 大鼠臨床表現 實驗組及正常對照組大鼠每日給藥后30 min內均出現倦怠懶動，考慮與麻藥作用有關，毛發色澤及排泄物均正常，2 h后恢復正常活動狀態。直至觀察期結束，大鼠死亡情況見表4，實驗大鼠均未出現毒性反應。見表4。

6.2.2 大鼠體質量變化情況 兩組大鼠體質量均呈現增長趨勢，且兩組比較無統計學差異。見表5。

6.2.3 大鼠解剖觀察結果 給藥24 h時各組解剖1只大鼠觀察直腸黏膜，兩組均無充血、水腫現象，灌腸部位黏膜完整，無異常分泌物，血管走形清晰。連續給藥7 d后每組解剖5只大鼠觀察直腸黏膜，兩組直腸黏膜結構正常，黏膜完整，無異常分泌物、局部硬結及充血水腫等。兩組剩余4只動物停藥繼續觀察1周，均未見明顯異常。評分結果見表6及表7。

6.2.4 大鼠腸道組織病理學檢查結果 正常對照組：腸黏膜完整，無潰瘍，黏膜腺體間無淋巴細胞浸潤，淺表無糜爛及不典型增生，可見散在杯狀細胞。實驗組：腸壁黏膜全層關系清晰，結構無改變，無糜爛、潰瘍，黏膜腺體間無淋巴細胞浸潤，可見杯狀細胞。兩組直腸病理檢查結果均正常。見圖2。

7 討論

急性毒性實驗是一次性給予實驗動物某種受試物后，觀察在短時間內對實驗動物所產生的毒性反應的實驗方法[9-10]。復方苦參灌腸劑臨床給藥成人每日劑量為230 g/60 kg，小鼠灌腸一次性最大給藥量為1 680 g/60 kg，應用復方苦參灌腸劑對小鼠進行急性毒性實驗，以可灌腸最高濃度0.7 g/mL，24 h內灌腸給藥兩次（相當于成人臨床每日等效用量的14.6倍）。連續觀察14 d，未見動物出現毒性反應，體質量變化無統計學差異，病理組織檢查未見明顯變化，因此本品小鼠灌腸最大耐受劑量＞1680g/60kg。在本次實驗條件下，復方苦參灌腸劑多次直腸給藥對大鼠直腸黏膜無刺激性，且對大鼠體質量及直腸病理檢查無明顯改變。

表3 復方苦參灌腸劑急性毒性實驗對小鼠體質量的影響（±s）g

表3 復方苦參灌腸劑急性毒性實驗對小鼠體質量的影響（±s）g

組別 n 性別 第1天 第2天 第3天 第4天 第7天 第1 0天 第1 4天正常對照組 1 0 雌 2 5.0±3.4 2 6.6±3.2 2 7.4±3.5 2 9.0±3.7 3 1.5±6.3 3 2.7±6.8 3 4.4±3.6 1 0 雄 2 9.1±1.4 3 0.7±2.0 3 2.1±2.3 3 3.1±3.7 3 6.9±2.9 3 9.0±3.2 4 1.1±3.7實驗組 1 0 雌 2 2.9±2.3 2 5.0±2.5 2 5.7±2.7 2 6.1±3.3 2 8.7±4.1 3 0.2±3.9 3 1.6±2.4 1 0 雄 2 9.1±2.4 3 1.5±2.0 3 2.4±1.8 3 3.8±2.3 3 8.1±3.2 4 0.4±2.9 4 2.7±3.5

圖1 兩組小鼠各器官病理染色結果（200×）

表4 復方苦參灌腸劑直腸黏膜刺激實驗大鼠死亡情況

表5 復方苦參灌腸劑直腸黏膜刺激實驗大鼠體質量變化情況（±s）g

表5 復方苦參灌腸劑直腸黏膜刺激實驗大鼠體質量變化情況（±s）g

組別 n 性別 給藥前 第1天 第7天 第1 4天正常對照組 1 0 雌 1 6 6.0± 9.2 1 6 7.2± 7.8 1 8 5.8±2 1.9 2 0 3.4±1 4.1 1 0 雄 1 9 6.0±1 2.1 1 9 7.1±1 1.9 1 9 9.5±1 5.7 2 1 4.7± 0.7實驗組 1 0 雌 1 7 0.7±8.0 1 7 1.3±6.2 1 8 3.4±3.6 2 0 5.2±7.3 1 0 雄 1 9 7.9± 6.7 1 9 8.2± 7.1 2 1 9.4±2 3.4 2 7 7.2± 8.0

表6 給藥期評價結果

表7 停藥觀察期評價結果

圖2 兩組直腸病理檢查結果（200×）

8 結論

急性毒性實驗表明復方苦參灌腸劑在最大給藥量時對小鼠內臟無急性毒副作用，故臨床擬用灌腸劑量是安全的。直腸黏膜刺激實驗表明復方苦參灌腸劑多次直腸給藥對大鼠直腸黏膜無刺激性，對黏膜組織無病理性損傷。因此該藥臨床灌腸給藥安全可靠，值得臨床推廣應用。