經(jīng)多色流式細(xì)胞術(shù)確診多發(fā)性骨髓瘤并發(fā)惡性胸腔積液6例臨床特征分析

王夢園 馬莉 管俊

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為血液系統(tǒng)發(fā)病率位居第二位的惡性腫瘤，是起源于B細(xì)胞的惡性克隆性漿細(xì)胞疾病。通常骨髓瘤細(xì)胞僅局限于骨髓，但其也可擴(kuò)散并滲透到其他部位，如胸膜、淋巴結(jié)和肺臟等［1］，從而產(chǎn)生惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）。本研究主要探討由更為敏感的多色流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）確診的6 例MM并發(fā)MPE患者的臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和轉(zhuǎn)歸情況，旨在強(qiáng)調(diào)FCM 對MPE 的診斷價值及增加對MM并發(fā)MPE患者臨床特點(diǎn)的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 病例資料

分析2016年7月至2019年10月江蘇省蘇北人民醫(yī)院經(jīng)FCM診斷的6例MM并發(fā)MPE患者，其中男性4 例，女性2 例，年齡范圍49～72 歲，中位年齡62歲。MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用國際骨髓瘤工作組（IMWG）指南。胸腔積液的診斷標(biāo)準(zhǔn)為影像學(xué)檢查（胸部X線、胸部CT或超聲）發(fā)現(xiàn)胸腔積液同時行胸腔穿刺檢查。MPE的診斷則依據(jù)胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢查和（或）FCM 檢查。按照Durie-Salmon（DS）分期體系及國際分期系統(tǒng)（ISS）進(jìn)行分期，按照血清肌酐水平分組。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、分期、分型和出現(xiàn)胸腔積液的時間以及隨訪截至2020年5月1日患者的總生存時間，同時收集患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，胸水常規(guī)、生化及脫落細(xì)胞學(xué)檢查，對所有胸腔積液進(jìn)行FCM檢測。

1.2.2 主要試劑及儀器 CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP/CD138-APC、CD138-FITC/CD117-PE/CD28-PerCP/CD27-APC、CD200-PE/CD45-PerCP/CD138-APC、κ-FITC/λ-PE/CD138-APC、溶血素、破膜劑，上述試劑均購自美國貝克曼庫爾特公司。Dx?FLEX流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 多色流式細(xì)胞法：取新鮮胸腔積液200～500 mL，過濾后以肝素抗凝，以1 000 r/min的速度離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次，細(xì)胞沉淀用PBS制成細(xì)胞濃度為106/mL的單細(xì)胞懸液，分成5管，分別加入100 mL單細(xì)胞懸液，1管為空白對照，2、3、4 管 加 入CD38- FITC/CD56- PE/CD19- PerCP/CD138-APC、CD138-FITC/CD117-PE/CD28-PerCP/CD27-APC、CD200-PE/CD45-PerCP/CD138-APC、κ-FITC/λ-PE/CD138-APC 抗體各10 μL，充分混勻，于室溫避光孵育15 min，加入1∶9 配制的溶血素2 mL，避光8 min 后，以1 000 r/min 的速度離心5 min，棄上清液，PBS 緩沖液0.5 mL 再懸浮細(xì)胞。第5 管加入1號固定劑，于室溫避光孵育15 min，加1 mL PBS緩沖液震蕩，以1 000 r/min 的速度離心5 min，棄上清液，加入2 號固定劑，靜置5 min，加入κ-FITC/λ-PE/CD138-APC 抗體各10 mL，充分混勻，于室溫避光孵育15 min，加1 mL PBS 緩沖液震蕩，以1 000 r/min 的速度離心5 min，棄上清液，PBS緩沖液0.5 mL再懸浮細(xì)胞，用DxFLEX 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用Cytex?pert 軟件獲取與分析數(shù)據(jù)。建立FSC/SSC，每管獲取20 000個細(xì)胞，根據(jù)同型對照分析。檢測細(xì)胞CD19、CD38、CD45、CD56、CD138和κ、λ的表達(dá)情況。

脫落細(xì)胞學(xué)檢查：取胸腔積液標(biāo)本10 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清液留取沉淀物，混勻后制片，經(jīng)自然干燥后用瑞－姬染色，光鏡下進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。研究中連續(xù)變量以±s表示，分類變量以率（構(gòu)成比）表示，相關(guān)性分析雙變量正態(tài)分布采用Pearson 相關(guān)性分析，不符合雙變量正態(tài)分布采用Sperman 相關(guān)性分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

按照ISS 分期：Ⅰ期1 例，Ⅱ期4 例，Ⅲ期1 例。DS 分期：Ⅰ期1 例，Ⅱ期2 例，Ⅲ期3 例。6 例患者均為A 組。分型：IgA-κ 型1 例，IgG-κ 型1 例，IgA-λ 型2例，IgG-λ型1例，κ輕鏈型1例。其中4例為早發(fā)性滲出，另外3 例為遲發(fā)性滲出，早發(fā)性滲出被定義為在MM 診斷時或在第1 個化療周期發(fā)生的滲出。遲發(fā)性滲出是指在第1個周期化療后發(fā)生的滲出［2］，見表1。

2.2 胸腔積液特征

2.2.1 胸腔積液部位及性質(zhì) 6例MPE患者中，所有患者均出現(xiàn)雙側(cè)大量胸腔積液，胸腔積液顏色1例為紅色，1例為淺黃色，4例為黃色。李凡他試驗(yàn)中4例陽性，2例弱陽性。6例胸水中乳酸脫氫酶（lactate de?hydrogenase，LDH）水平76～1 328 U/L（中位88 U/L），腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）0～51 U/L（中位45 U/L），白細(xì)胞17×106～742×106/L（中位135.5×106/L），單個核細(xì)胞數(shù)13×106～680×106/L（中位124.5×106/L）。6 例患者行胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查，鏡下見淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及間皮細(xì)胞，均未見癌細(xì)胞。

用多色流式細(xì)胞儀對6 例患者的胸水進(jìn)行免疫表型分析，表達(dá)的漿細(xì)胞分別占有核細(xì)胞數(shù)的59.10%、0.71%、1.34%、1.90%、0.38%和29.80%。表2總結(jié)了6例患者的胸水骨髓瘤細(xì)胞免疫表型。

2.2.2 胸水漿細(xì)胞百分比與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性分析 分析6 例經(jīng)FCM 確診的MM 并發(fā)MPE 患者胸水漿細(xì)胞比例與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，結(jié)果顯示胸水漿細(xì)胞比例與胸水總蛋白、白蛋白、球蛋白、LDH水平、ADA 及初診時骨髓漿細(xì)胞比例成正相關(guān)（P<0.05），與胸水常規(guī)紅細(xì)胞數(shù)、單個核細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)以及血清血紅蛋白、血小板、總蛋白、白蛋白、LDH 水平、ADA、β2-微球蛋白均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。見圖1，表3。

2.3 治療及轉(zhuǎn)歸

隨訪截至2020年5月1日，共有4 例（66.7%）MPE 患者死亡，2 例（33.3%）患者存活。病例1 在確診MPE 17 個月后死于疾病進(jìn)展。病例2 在第1 次PAD（硼替佐米+多柔比星+地塞米松）方案化療中出現(xiàn)MPE，經(jīng)3 個療程PCD（硼替佐米+環(huán)磷酰胺+地塞米松）方案治療后，胸腔積液基本消失，此后患者未予治療，4 個月后疾病進(jìn)展，最終死于漿細(xì)胞白血病。病例3 出現(xiàn)心肌淀粉樣變，給予PTD 方案（硼替佐米+沙利度胺+地塞米松）化療后胸水未消失，通過FCM找到異常漿細(xì)胞，后改為PCD方案，最終死于疾病進(jìn)展。病例4 入院時即存在MPE，經(jīng)過2 個療程PTD 方案治療后，患者出現(xiàn)呼吸心跳驟停，心肺復(fù)蘇后轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)室，最后死亡。病例5 在第1 次PCD方案化療結(jié)束后出現(xiàn)MPE，后改為BRD方案（硼替佐米+來那度胺+地塞米松），因出現(xiàn)全身廣泛皮疹，考慮來那度胺過敏，給予BD 方案（硼替佐米+地塞米松）化療，胸腔積液未消失，后未于本院治療，目前仍然生存。病例6經(jīng)2個療程PCD方案后，胸腔積液基本消失，第3 個療程結(jié)束后骨髓示緩解期骨髓象，游離輕鏈陰性，后行第4 個療程PCD 方案化療，游離輕鏈轉(zhuǎn)陽性，患者要求轉(zhuǎn)入當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療，截至隨訪結(jié)束日期仍然生存。

表2 6例MM并發(fā)MPE患者的胸水免疫表型特征

圖1 病例6胸水流式分析散點(diǎn)圖

表3 胸水漿細(xì)胞比例與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

MM為一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，主要表現(xiàn)為CRAB 癥狀：高鈣血癥、腎衰竭、貧血和溶骨性損害，但也有約6%MM患者出現(xiàn)以胸腔積液為主要表現(xiàn)的呼吸困難［3］。MM合并胸腔積液產(chǎn)生的原因主要為鄰近骨骼或腫瘤的胸膜腔受累、縱隔淋巴結(jié)浸潤伴淋巴阻塞、胸膜或肺淀粉樣變，同時MM 可并發(fā)腎病綜合征、慢性腎功能衰竭、淀粉樣心肌病、感染、低蛋白血癥和肺栓塞，上述癥狀均可導(dǎo)致胸腔積液的發(fā)生［4］。骨髓瘤細(xì)胞直接累及胸膜腔產(chǎn)生的MPE 極為罕見，發(fā)生率<1%。本院報道的MPE 發(fā)生率高于既往研究，主要原因可能為對所有MM并發(fā)胸腔積液可抽液樣本均進(jìn)行傳統(tǒng)常規(guī)胸水細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合FCM檢查。

目前，對于MM 并發(fā)MPE 的檢查主要包括胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查，雖然單純的病理涂片具有較高的特異性，但其敏感性較低，涂片的染色質(zhì)量可能會妨礙脫落細(xì)胞學(xué)診斷［5］。因此，流式細(xì)胞術(shù)在診斷MM并發(fā)MPE過程中發(fā)揮較大作用。

意大利國家癌癥研究所有數(shù)據(jù)有力地支持FCM作為一種簡單可靠的技術(shù)，在胸水樣本中可以明確鑒定腫瘤漿細(xì)胞，而且明顯比細(xì)胞學(xué)檢查更敏感［6］。目前，認(rèn)為CD138、CD38、CD45、CD19和CD56均是可鑒別良惡性漿細(xì)胞的主要免疫表型［7］。本研究運(yùn)用FCM 檢測，均可從6 例患者胸腔積液中找到漿細(xì)胞，但胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查均未見癌細(xì)胞。所有患者CD38及CD138均為陽性，除病例6之外，所有患者CD19均為陰性。病例4雖然κ和λ均為陽性，但κ/λ>4.0，仍有意義。因此，有必要將FCM納入胸腔積液的常規(guī)檢查中，其在鑒別胸腔積液良惡性中發(fā)揮重要作用。

Zhong等［8］研究發(fā)現(xiàn)，23例MM合并MPE患者，其中男性11 例，女性12 例，中位年齡為56.8（37～68歲），大多數(shù)患者為IgA 亞型，其次為IgG 亞型。該研究男性患者多于女性，中位年齡62（49～72）歲，與既往研究相似，IgA型占大多數(shù)（50%），IgG型占30%，這可能與IgA 骨髓瘤患者13 號染色體缺失發(fā)生率較高有關(guān)［9］。但因本研究樣本數(shù)較少，同時克隆性漿細(xì)胞未做分選，6例患者染色體均為正常核型。

MM患者產(chǎn)生MPE往往預(yù)示著疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，為疾病進(jìn)入晚期的表現(xiàn)。先前的報道指出骨髓瘤性積液患者的總生存期（overall survival，OS）明顯少于無骨髓瘤性胸腔積液的患者（P=0.002）［2］。Cho 等［10］研究表明，MM 伴MPE 預(yù)后較差，MPE 發(fā)生后患者中位生存時間（median OS，mOS）為2.8（0.2～15.6）個月，總死亡率為57.9%。Kamble 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，13 號染色體缺失在MM 伴MPE 患者中出現(xiàn)率較高，這可能解釋了MPE 與不良預(yù)后之間的關(guān)系，約90%漿膜腔浸潤的MM 患者在確診后1年內(nèi)死亡［11］。在本研究中，6 例患者在隨訪結(jié)束后，4 例死亡，2 例生存，mOS 為7.5（2～36）個月，MPE 出現(xiàn)后的mOS 為6.5（2～17）個月，研究結(jié)果與上述研究基本相符。

目前，骨髓瘤性胸腔積液的治療應(yīng)以化療聯(lián)合胸腔引流為主［9］。胸膜內(nèi)予以順鉑治療可以緩解MPE 癥狀，但對預(yù)后無影響［12］。Ye 等［13］報道1 例以骨髓瘤性胸腔積液為首發(fā)癥狀的患者，最初予以Cy?BorD（環(huán)磷酰胺+硼替佐米+地塞米松）方案化療。然而，MPE 快速積聚，后來將化療方案更換為硼替佐米+達(dá)雷木單抗+地塞米松方案，1個月內(nèi)胸腔積液基本消失。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IgG-κ 亞型MM 并發(fā)MPE 的患者，最初對地塞米松有良好的反應(yīng)［14］。Zhong 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，MM 并發(fā)MPE 的患者對聯(lián)合硼替佐米的治療具有一定反應(yīng)。硼替佐米為一種新型的蛋白酶體抑制劑，具有明顯的抗骨髓瘤活性。然而，硼替佐米可能引起肺損傷，出現(xiàn)肺部并發(fā)癥，其中包括胸腔積液［15］。因此，這為應(yīng)用蛋白酶體抑制劑治療MM并發(fā)胸腔積液增加了更多的挑戰(zhàn)［16］。

綜上所述，本研究認(rèn)為在胸腔積液常規(guī)檢查基礎(chǔ)上，亟需聯(lián)合更為敏感的FCM 檢查，以便提高M(jìn)M并發(fā)MPE診斷的陽性率，從而更好地判斷預(yù)后，指導(dǎo)臨床個體化治療。