纖維素酶降解纖維素的機制及其在畜牧業中的應用

寧俊平，孫玲利，孫如玉，徐瑩，張旭陽，張淑芳

（1.汝州市畜牧局，河南 汝州 467500；2.河南農業職業學院；3.廣西壯族自治區畜牧研究所）

1 纖維素酶的分子結構及作用特征

1906 年，Seilliere 發現蝸牛的消化液能夠水解棉花纖維素并產生葡萄糖，這是人類首次發現纖維素酶；1933年，Grassman等研究了一種真菌的纖維素酶系，分離出兩個組分，這是人們首次從真菌中分離出纖維素酶，此后纖維素酶的研究和應用便逐步受到世界各國的普遍關注。

纖維素分解酶是一種多組分的復合酶系，是能夠將纖維素降解轉化生成葡萄糖的一組酶的總稱。纖維素酶主要通過水解作用，使連接葡萄糖分子的β-l，4-糖苷鍵斷裂，最終將纖維素分解成單個的葡萄糖分子。諸多研究普遍表明，纖維素的完全降解至少需要三種酶，根據其催化作用不同，分為：①內切-β-1，4-葡聚糖酶（endo-β-1，4-glucanase，EG）：該酶是纖維素酶系中最重要的酶，由于此酶的活性經常由CMC 作為底物測量，因此也稱CMCase、Cx 酶。這類酶主要作用于纖維素分子內部的非結晶區，隨機水解β-l，4-糖苷鍵，從而將纖維素長鏈分子截短，產生大量具有還原性末端的小分子纖維素。②外切-β-1，4-葡聚糖酶（exo-β-1，4-glucanase，CBH）：這類酶可從纖維素分子的還原或非還原端切割糖苷鍵，每作用一次可生成一個纖維二糖分子，但是經過該酶充分作用的微晶纖維素則最終生成纖維糊精和纖維二糖，所以也叫纖維二糖水解酶（簡稱CBH）或C1 酶。③β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG）：它能水解纖維二糖生成單個的葡萄糖分子，由于該酶不直接作用于纖維素，可以消除上述兩種酶產物對水解反應的抑制作用，因此可快速水解纖維二糖和纖維三糖。這三種酶功能雖不同，但具有互補作用的活性酶組分，三者以接力方式把長鏈纖維素逐步降解成短鏈，再降解成二糖結構，最后生成單糖，整個反應過程需要各種酶之間相互配合作用，缺一不可。當然實際的纖維素酶系遠不止三種，一些纖維素酶也不僅僅只參與纖維素降解的單個步驟。

2 纖維素酶的催化機制

目前，關于纖維素酶的降解機制普遍接受的是協同作用模型，該酶在降解過程中，首先由CX酶在纖維素聚合物的內部起作用，在纖維素的非結晶部位進行切割產生新的末端，然后再由C1 酶以纖維二糖為單位，從末端進行水解，后由β-1，4-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖，如圖1。

圖1 纖維素酶系協同降解纖維素的過程

3 纖維素酶活性的測定

3.1 總酶活力的測定方法

纖維素酶是多組分酶，各組分間有協同作用，會形成多種產物和涉及多種反饋控制機理，這就使得酶活力測定方法非常困難，國內外報道過的測定纖維素酶活力的方法很多，其中運用較廣泛、有代表性的有以下幾種。

3.1.1 濾紙崩潰法

由于濾紙所含纖維素結構與天然纖維素相似，以濾紙為底物測定酶活力更有代表性。通常采用恒溫振蕩器，將一定規則的濾紙片作為底物浸入裝有酶液的試管中，在最佳溫度和最佳pH 值條件下微振蕩，直至濾紙崩潰。計算濾紙完全崩潰所需的時間，求得酶活力。在此基礎上發展的測定濾紙失重情況來測定酶活力，克服了由于測定濾紙的崩潰時間較難確定而造成誤差大的問題。在一定溫度和最佳pH 值條件下，讓酶液與濾紙保溫反應一段較長的時間，一般需要兩個星期以上，然后將濾紙條水洗、烘干，測量出濾紙前后的質量變化，算出濾紙失重率，求得酶活力。

3.1.2 棉線切斷法

將細棉線的一端浸入含有適量酶液的試管中，在一定溫度和最佳pH 值條件下微振蕩，測定棉線被切斷所需的時間，求得酶活力。

3.1.3 分光光度計法

當酶促反應發生，生成的糖類物質與顯色劑發生顯色反應，用分光光度計在500 nm 左右的波長范圍內測定吸光度，換算成還原糖含量，然后計算出酶活力。德國的萃取化學公司率先開發出了用CMC 鈉鹽作底物，以2-羥基-3，5-二硝基苯甲酸作顯色劑的分光光度計法。分光光度計法可大大縮短酶活力測定所需要的時間，而且精確度高，得到了廣泛應用。國內外許多科研機構根據自己的研究目的，采用不同的顯色劑和底物，又由此衍生出更多的方法。日本受就此啟發，開發出了濁度法，用0.03%微晶纖維素（Avicel）在最佳溫度和pH 值條件下經過酶液作用后，通過分光光度計來測定溶液濁度的減少來代表酶活力。

3.1.4 粘度測定法

由于發現纖維素酶不僅能液化粘度較大的羧甲基纖維素鈉溶液，而且酶活力與溶液的液化程度成正相關，因此可以通過測定CMC 粘度降低推算出酶活力，有旋轉粘度計法和工研法兩種。

3.1.5 平板法

利用磷酸膨脹纖維素制成均勻的雙層平板，纖維素酶能在其上形成清晰的透明圈，利用此法可在平板上對纖維素酶產生菌進行篩選，可以大大提高工作效率。此法廣泛應用于產纖維素酶的真菌選育中。

3.2 單一纖維素酶組分活力的測定

近年來國內外通用的和新提出的一些纖維素酶活力測定方法大都是采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法來測定還原糖的生成量，該法簡單、靈敏。

3.2.1 外切葡聚糖酶（CBH）活力測定

Desphande 等以合成的PNPC 為底物，以對硝基苯的生成量用于檢測CBH活力，劉潔等人依據CBH、EG 和CB三類組分在棉纖維上吸附和脫吸能力不同設計出了一種簡易測定CBH 的方法，日本還采用微晶纖維素為底物水解得還原糖量計算酶活力，同樣可得到CBH活力。

3.2.2 內切葡聚糖酶（EG）活力的測定

以無定形纖維素為底物，以還原糖的生成量可表征EG組分活力。Ghose所推薦的測定EG酶活力的方法是：用0.5 mL 2% CMC 于0.05 mol/ L 檸檬酸緩沖溶液中，50 ℃反應30 min，加入的酶液量以能形成0.5 mg 葡萄糖為準，然后DNS法測定糖生成量，然后計算出酶活力。此外，還可以利用測定高分子溶液粘度來導出其聚合度和分子量的方法來表征EG 活力，此法可測得初速度，因而確切反映EG活力，且靈敏度較高。

3.2.3 纖維二糖酶（CB）活力測定

從纖維素酶解機制來看，可以纖維素二糖為底物，經過酶解后測葡萄糖生成量表征纖維二糖酶活力。由于纖維二糖和葡萄糖都具有還原性，通常的定糖方法不能區分，常用人工合成的糖苷化合物，如對硝基酚-β-葡萄糖苷、水楊素等作底物測定產生的對硝基酚或葡萄糖生成量。而各種β-葡萄糖苷組分對糖基和糖苷基專一性的要求有差別，因此得到的結果通稱為β-葡萄糖苷酶活，與纖維素二糖酶活有區別。

4 纖維素酶在畜牧業上的應用

纖維素酶作為一種新型飼料添加劑，能將麥秸、稻草、玉米芯等粗飼料轉化為糖、菌體蛋白等，從而降低飼料中的粗纖維含量，提高粗飼料營養價值，在畜牧生產中發揮著極大的作用。其功效體現在：①單胃動物如豬、雞等體內由于缺乏內源性纖維素酶，不能消化纖維素，日糧添加纖維素酶可補充內源酶的不足，改善腸道菌群，提高其對粗纖維的利用率。②纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶協同作用可破壞植物的細胞壁，促使細胞內容物釋放，提高養分的消化和非淀粉多糖的利用率。③添加纖維素酶可去除果膠、半纖維素、β-葡聚糖和戊聚糖等抗營養因子造成的吸收障礙，增加內源酶的擴散，并使酶與養分充分接觸，促進飼料的良好消化吸收。④可維持小腸絨毛形態完整，促進營養物質的吸收。大量的試驗也證明了飼料中添加纖維素酶對豬、雞、牛、羊、魚等的飼喂效果十分顯著。匈牙利學者在豬飼料中按纖維含量的1%添加纖維素酶可提高豬日增重5%，改善飼料轉化效率7.8%。日本研究人員證明雞日糧中添加0.2%的纖維素酶，可使雞日增重提高5%～10%。

綜上，近年來，對纖維素的應用研究不斷深入，尤其篩選高效的纖維素酶降解纖維素已成為研究熱點。該文對纖維素酶的結構特性、催化機制、酶活測定方法及應用進行論述，今后可加大對纖維素酶的產酶條件進行優化，并通過數學模型進行定量分析，以確立最佳產酶條件并利于酶系的篩選。