三種食用菌提取物體外抗氧化與降血糖活性研究

羅麗平,李冰晶,趙景芳,楊 玲,*,李 威

(1.貴州省生物研究所,貴州貴陽 550009;2.貴州省貴福菌業發展有限公司,貴州貴陽 550009)

食用菌是一味傳統的保健食材,在《呂氏春秋》、《本草綱目》中均有相關記載[1-2],長期食用食用菌,可補充身體中的所需營養,不僅利于預防疾病,還有利于健康長壽[3]。食用菌是指大型真菌中能形成具有膠質或肉質子實體或菌核組織并能食用或藥用的菌類。世界能區分的約12萬種已報道的有2000多種,我國報道的有981種,人工栽培的70余種,大規模生產的20 余種[4]。食用菌不僅肉質脆嫩、味道鮮美,且營養價值高。其中不僅含醇類、酯類、醛類、有機酸類等風味物質還含有豐富的氨基酸、核苷酸和糖水化合物[5]。近年來越來越多的研究表明食用菌具有抗氧化[6]、抗菌消炎[7]、降血糖(脂)[8]、增強機體免疫功抑制腫瘤生長等生物活性并得出食用菌多糖是一種非特異性免疫增強劑和免疫激活劑[9-10],部分食用真菌多糖已被廣泛應用于醫藥、食品和保健品行業[11]。近年來隨著脫貧攻堅農村產業革命的開展,貴州省把食用菌作為農村重點發展的產業之一,自此貴州省各食用菌種植面積呈逐年上升趨勢并成效顯著。本研究以茶樹菇、松乳菇、竹蓀和竹蓀菌托為研究對象,主要是因為近年來貴州省的茶樹菇和竹蓀產業迅速發展,鮮菇產量高,但產業的過度發展會導致初級產品的過剩、滯銷;其次松乳菇是貴州特色野生食用菌,開發價值極高;另外竹蓀菌托是竹蓀的副產物,采摘竹蓀子實體后一般讓其直接腐爛在地里,其中有效成分沒有得到利用造成極大浪,如能對其進行很好的開發利用變廢為寶,不僅可減少環境污染,還可通過高附加值產品的開發來提高食用菌的產值,從而延長產業鏈。且目前關于松乳菇、竹蓀抗氧化和降血糖作用的研究報道甚少,雖對茶樹菇抗氧化作用的研究有一定的報道,但其他活性還未被開發出來。實驗對三種食用菌及副產物的提取物進行抗氧化和降血糖進行考察,旨在盡可能開發出食用菌的食、藥兩用價值，為食用菌高附加值產品的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮竹蓀 由貴州省織金縣“匯苑特色農業有限公司”提供;新鮮茶樹菇 由“貴州省貴福菌業發展有限公司”提供;野生新鮮松乳菇 采摘于貴陽市花溪區高坡鄉;二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) 百靈威公司;α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷 上海伊卡生物技術有限公司;可溶性淀粉、二硝基水楊酸、PBS緩沖液、Na2CO3、抗壞血酸、H2O2、FeSO4、水楊酸 天津市致遠化學試劑有限公司;鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇 均為分析純,重慶川東化工有限公司;實驗用水 均為二級水。

DZF-6021真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;EYELA N-3000循轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司;循環水式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;DK-98-II水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;ISO9001型電子天平 北京賽多麗斯儀器系統有限公司;SB25-12DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;LGJ-18型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展公司;HP-845型紫外可見分光光度計 上海精科實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將新鮮的竹蓀子實體和竹蓀菌托分離并用水洗去表面塵土后置于烘箱中50 ℃烘干、粉碎成粉末,同樣將新鮮的茶樹菇和松乳菇用水洗去表面塵土后置于烘箱中50 ℃烘干、粉碎成粉末。提取方法參照[12]并略做改進,稱取適量的原料粉末,置于燒瓶中,向燒瓶中加入相當于原料8倍的蒸餾水,浸泡2 h后,80 ℃回流提取兩次,每次2 h。合并提取液,減壓濃縮后,用85%的乙醇對濃縮液進行醇沉處理,4 ℃靜置過夜,去掉上清,50 ℃減壓濃縮后于真空干燥箱中50 ℃真空干燥得到各提取物。稱取各被試樣品適量,將其用蒸餾水溶解并定容于容量瓶中配制成為5 mg/mL的樣品溶液,將備試樣稀釋成所需濃度以備實驗使用。由于樣品本身溶解性和樣品溶液本身顏色的影響,本實驗測定的樣品濃度范圍為0.5～5 mg/mL，最大濃度為5 mg/mL,此濃度時樣品溶解性相對較好,濃度繼續增大無研究意義。

1.2.2 抗氧化活性測定

1.2.2.1 提取物對·OH清除率的測定 本研究采用水楊酸顯色法[13]進行測定。反應體系由1 mL 8 mmol/L FeSO4,1 mL 8 mmol/L H2O2,1 mL 8 mmol/L水楊酸,1 mL蒸餾水,1 mL相應濃度的被試樣品溶液。反應體系體積共計5 mL,將混合體系搖勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋中加熱反應30 min,后于510 nm處測定混合體系的吸光值(A1),用1 mL的蒸餾水代替反應體系中的水楊酸測得樣品本底吸光值(A2),用1 mL的蒸餾水代替反應體系中的樣品測得空白吸光值(A0)。以VC作為陽性對照,其測定方法相同。每組實驗做三個平行,最終值取三次的平均值,清除率計算公式[14]見式(1)。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

1.2.2.2 提取物對DPPH·清除能力測定 本研究參照[15-16]的檢測方法。反應體系由1 mL不同濃度的被測樣品溶液,1 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液和2 mL蒸餾水組成。將反應組合搖勻后置于25 ℃恒溫水浴鍋中避光加熱反應15 min,后于517 nm處測定混合反應體系的吸光值(A1)。用1 mL的蒸餾水代替1 mL的DPPH·溶液其余成分相同,測得樣品的本底吸光值(A2),用1 mL的蒸餾水代替1 mL的樣品溶液其余成分相同,測得空白吸光值(A0)。以VC作為陽性對照。每組實驗做三個平行,最終值取三次值的平均值,清除率計算公式見式(2)。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(2)

1.2.2.3 提取物對Fe3+總還原力測定 物質對Fe3+的還原能力也是常用的評價物質抗氧化能力的重要指標之一,實驗一般采用鐵氰化鉀顯色法[17]來對物質的還原能力進行測定。取各不同濃度被試樣品1 mL,加入pH6.8的PBS緩沖液1 mL及1%的鐵氰化鉀溶液1 mL,搖勻后置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱反應30 min。加熱反應結束后取出并急速冷卻后加入已配制好的10%的三氯乙酸溶液1 mL,充分混勻后4000 r/min離心10 min,取上清液1 mL并加入0.1%的三氯化鐵溶液1 mL,隨后加入3 mL的蒸餾水,混勻后于700 nm處測定此反應體系的吸光值(A1),以1 mL的蒸餾水代替不同濃度的試樣品其他操作相同在700 nm處測得空白吸光值(A0)。以VC作陽性對照其他操作相同測定吸光值。以(A1-A0)的值來衡量提取物還原能力的強弱,還原力的強弱與吸光值的大小成正相關[18]。每組實驗做三個平行,最終值取三次的平均值。

1.2.3 降血糖活性測定

1.2.3.1 提取物對α-淀粉酶活性抑制作用測定 本研究采用二硝基水楊酸(DNS)法[19]來測定被試樣對α-淀粉酶活性的影響。向2 mL磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中加入0.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液和4 mL DNS作為空白調零,以1 mL緩沖液1 mL 1%α-淀粉酶溶液、0.5 mL 0.5%的淀粉和4 mL DNS 作為對照組測得A。取1 mL的被試樣品溶液,再加入PBS定容至2 mL,再加入1 mLα-淀粉酶溶液,搖勻。放入37 ℃水浴預熱10 min后,加入0.5 mL 0.5%的淀粉溶液,在37 ℃恒溫水浴鍋中反應10 min取出并加入4 mL DNS溶液,后置于沸水浴中5 min,待冷卻后于540 nm下測得值A1。另取一組適量濃度的被試樣品溶液作為本底組,加入緩沖液定容至3 mL,置于37 ℃水浴預熱10 min后,加入0.5 mL PBS,37 ℃水浴10 min,加入4 mL PBS溶液,置于沸水中水浴 5 min,待冷卻后于540 nm下測得吸光值A0。每組實驗做三個平行,最終值取三次的平均值,抑制率計算[20]公式見式(3)。

抑制率(%)=[1-(A1-A0)/A]×100

式(3)

1.2.3.2 提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用測定 本研究采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)比色法[21-22]測定被試樣品對α-葡萄糖苷酶活性的影響。以向4 mL磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中加入1 mL 0.1 mmol/L PNPG和1 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液作為空白調零組。以向3 mL緩沖液1 mL 20 mg/mLα-葡萄糖苷酶加入1 mL PNPG和1 mL Na2CO3溶液為對照組在400 nm處測得A。取被試樣品溶液,加入緩沖液定容至3 mL,后加入1 mLα-葡萄糖苷酶溶液,搖勻后置于37 ℃水浴鍋中加熱反應10 min后加入1 mL PNPG繼續37 ℃水浴反應10 min,取出并加入1 mL Na2CO3溶液,搖勻于400 nm測得吸光值A1。另取被試樣品溶液加入緩沖液至4 mL,搖勻后于37 ℃水浴鍋中加熱10 min,隨后加入1 mL PNPG,繼續在37 ℃水浴中加熱10 min后取出加入1 mL Na2CO3溶液,于400 nm下測得A0。每組實驗做三個平行,最終值取三次的平均值,抑制率計算公式見式(4)。

抑制率(%)=[1-(A1-A0)/A]×100

式(4)

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件對實驗數據進行顯著性分析和作圖,并計算半數抑制濃度IC50值。抗氧化實驗各組均與陽性組進行比較,降血糖實驗進行組間比較。各組實驗均重復三次。

2 結果與分析

2.1 提取物對·OH的清除作用

由圖1可看出,各提取物對·OH均有一定的清除能力,當提取物濃度達到5 mg/mL時，各提取物對·OH的清除能力大小依次為茶樹菇提取物>VC>竹蓀提取物>竹蓀菌托提取物>松乳菇提取物。各提取物對·OH的清除能力與樣品濃度呈一定的量效關系,在實驗濃度范圍內隨著濃度的增加各提取物對·OH的清除能力也相應增強,其中茶樹菇提取物組的增長幅度較大,竹蓀提取物、竹蓀菌托提取物、松乳菇提取物組的增長幅度較小。當實驗濃度達到5 mg/mL時,茶樹菇提取物的清除率(89.45%)與VC(87.86%)相當,其他各組均弱于VC,竹蓀提取物和竹蓀菌托提取物對自由基的清除能力相對較弱,清除率分別為45.61%和43.34%,松乳菇提取物對自由基的清除能力也較弱,清除率只有28.58%。

圖1 食用菌提取物對·OH的清除作用

由表1可知,各提取物對·OH清除活性的IC50值大小依次為松乳菇提取物>竹蓀提取物>竹蓀菌托提取物>茶樹菇提取物>VC。IC50值越小說明對自由基的清除能力越強。茶樹菇提取物對·OH清除活性的IC50值與VC接近且在實驗濃度范圍內,其他各組均超出VC的5倍，不在有效濃度范圍內,清除率相比VC較低,可認為竹蓀、竹蓀菌托、松乳菇提取物對·OH的清除能力均較弱,茶樹菇提取物對·OH的清除能力較強。

表1 食用菌提取物對·OH的清除活性的IC50值

2.2 提取物對DPPH·的清除作用

由圖2可看出,各提取物對DPPH·均有一定的清除作用，當提取物濃度達到5 mg/mL時，各提取物對DPPH·的清除率大小依次為VC>茶樹菇提取物>松乳菇提取物>竹蓀提取物>竹蓀菌托提取物。當實驗濃度在0.5～5 mg/mL時,各提取物表現出對DPPH·的清除能力與濃度呈一定的量效關系,除陽性組外茶樹菇提取物組的增長幅度較其他各組大。當濃度達到5 mg/mL時,茶樹菇提取物對DPPH·的清除率(87.81%)與VC(89.21%)相當。其他各組均弱于VC組。竹蓀和竹蓀菌托的提取物對DPPH·的清除能力均較弱,清除率為35.80%和34.35%，均達不到VC的一半。松乳菇提取物對DPPH·清除率為53.08%。

圖2 食用菌提取物對DPPH·的清除作用

由表2可知,各提取物對DPPH·清除活性的IC50值大小依次為竹蓀菌托提取物>竹蓀提取物>松乳菇提取物>茶樹菇提取物>VC。IC50值越小說明清除能力越強,除茶樹菇提取物和松乳菇提取物對DPPH·清除活性的IC50值均在實驗濃度范圍內,松乳菇提取物的IC50值雖在有效濃度范圍內,但很接近最大濃度,因此意義不大,可認為竹蓀、竹蓀菌托、松乳菇提取物對DPPH·的清除能力均較弱,茶樹菇提取物對DPPH·的清除能力較強。

表2 食用菌提取物對DPPH·清除活性的IC50值

2.3 提取物對Fe3+的還原作用

由圖3可以看出,各提取物對Fe3+具有不同程度的還原能力，當樣品濃度達到5 mg/mL時，各提取物對Fe3+的還原作用強弱依次為茶樹菇提取物>VC>竹蓀菌托提取物>竹蓀提取物>松乳菇提取物。在實驗濃度范圍內各提取物對Fe3+均表現出不同程度的還原能力且與濃度呈正相關。當濃度達到5 mg/mL時茶樹菇提取物對Fe3+的還原能力強于VC,松乳菇對Fe3+的還原能力較弱,竹蓀和竹蓀菌托提取物對Fe3+的還原能力相近但均弱于茶樹菇提取物和VC。

圖3 食用菌提取物對Fe3+的還原作用

由表3可知,各提取物對Fe3+還原能力的IC50值大小依次為松乳菇提取物>竹蓀提取物>竹蓀菌托提取物>茶樹菇提取物>VC。IC50值越小說明還原能力越強。茶樹菇提取物的IC50值在實驗濃度范圍內,還原能力與VC相當其他,而其他各組均是VC的5倍左右,還原能力對于VC來說及弱,可認為竹蓀、竹蓀菌托、松乳菇的提取物對Fe3+的還原能力均較弱,茶樹菇提取物對Fe3+的還原能力較強。

表3 食用菌提取物對Fe3+還原能力的IC50值

2.4 提取物對α-淀粉酶活性抑制作用

由圖4看出,各提取物對α-淀粉酶均有一定程度的抑制作用，樣品濃度達到5 mg/mL時，各提取物對α-淀粉酶活性抑制率大小依次為松乳菇提取物>茶樹菇提取物>竹蓀菌托提取物>竹蓀提取物。且各提取物對α-淀粉酶的活性均有不同程度的抑制作用,各提取物對α-淀粉酶的抑制作用與質量濃度呈一定的量效關系,抑制率隨濃度的增加均有不同程度的增加,其中松乳菇提取物組和茶樹菇提取物組的增長幅度最大,當濃度達到5 mg/mL時,松乳菇和茶樹菇提取物對α-淀粉酶活性的抑制率分別為83.52%和62.15%,而竹蓀和竹蓀菌托提取物對α-淀粉酶活性的抑制作用相對較弱只有14.15%和24.2%。

圖4 食用菌提取物對α-淀粉酶活性抑制作用

由表4可知,各提取物對α-淀粉酶活性抑制的IC50值大小依次為竹蓀提取物>竹蓀菌托提取物>茶樹菇提取物>松乳菇提取物。IC50值越小則表明抑制作用越強,茶樹菇和松乳菇提取物的IC50值在實驗濃度范圍內,而竹蓀及副產物的提取物在實驗濃度范圍內的抑制率均小于50%,說明二者對α-淀粉酶活性抑制作用均較弱,茶樹菇和松乳菇提取物對α-淀粉酶活性抑制作用較強。

表4 食用菌提取物對α-淀粉酶活性抑制的IC50值

2.5 提取物對 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用

由圖5看出,各提取物對α-葡萄糖苷酶的活性均有不同程度的抑制作用,當濃度達到5 mg/mL時，各提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制率大小依次為松乳菇提取物>茶樹菇提取物>竹蓀菌托提取物>竹蓀提取物。且各提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率與質量濃度呈現一定的量效關系,隨著各被試樣濃度的增加，抑制能力也在不同程度的增加,其中野生松乳菇提取物組和茶樹菇提取物的增加幅度相對較大,當濃度達到5 mg/mL時,松乳菇提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率為75.43%,茶樹菇提取物對該酶的抑制率為57.08%,而竹蓀和竹蓀菌托提取物的抑制率只有22.32%和20.63%。

圖5 食用菌提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用

由表5可知,各提取物對α-淀粉酶活性抑制的IC50值大小依次為竹蓀提取物>竹蓀菌托提取物>茶樹菇提取物>松乳菇提取物。IC50值的大小亦可表示抑制率的高低,IC50值越小說明抑制作用越強,茶樹菇和松乳菇提取物的IC50值在實驗濃度范圍內,竹蓀及副產物提取物在實驗濃度范圍內的抑制率均小于50%,說明二者對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均較弱,茶樹菇和松乳菇提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用較強。

表5 食用菌提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制的IC50值

3 討論與結論

自由基學說認為生命體會衰老是因為體內物質代謝產生的自由基容易與細胞內的脂質、蛋白質、DNA等組成物質發生反應[23],使得這些物質的結構和功能發生改變,最終導致機體衰老[24]。糖尿病是由遺傳、飲食、環境等因素導致的胰島素功能的衰減[25],從而導致胰島素敏感性低,影響相關代謝酶的活性[26],其中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶就是影響人體血糖水平最主要的兩種酶。α-葡萄糖苷酶能催化水解人體攝取的碳水化合物中的α-1,4-糖苷鍵,并釋放葡萄糖,促進了小腸對糖的吸收,使得血糖濃度升高[27]。而α-淀粉酶可水解淀粉內部的α-1,4-糖苷鍵并產生糊精、低聚糖和葡萄糖等物質。α-淀粉酶同樣會造成血液中血糖濃度升高[28]。因此,清除機體內的自由基和抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性能夠有效地延緩機體的衰老和降低機體的血糖水平,以達到延緩衰老和降血糖的目的,從而預防相應病并發癥。

本研究采用不同的反應體系對三種食用菌及副產物的提取物的體外抗氧化和降血糖活性進行了評價,實驗分別測定各提取物對·OH、DPPH·的清除能力和對Fe3+的還原能力以及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用來考察三種食用菌及副產物提取物的抗氧化和降血糖活性。在實驗濃度范圍內三種食用菌及副產物的提取物均表現出不同程度的抗氧化和降血糖活性,且呈現明顯的量效關系,當濃度達到5 mg/mL時,茶樹菇提取物對·OH和DPPH·的清除率最高可達89.45%和87.81%,對Fe3+的還原能力與VC相近,IC50均為1.04 mg/mL;而竹蓀和竹蓀菌托提取物對·OH(45.19%和36.04%)、DPPH·(44.30%和36.81%)的清除率和對Fe3+的還原能力(46.61%和48.09%)均較低,且IC50值均超出實驗濃度。當濃度達到5 mg/mL時,茶樹菇提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別62.15%和57.08%,IC50值為3.82和4.10 mg/mL;松乳菇提取物對兩種酶的抑制率分別為83.52%和75.43%,IC50值為2.22和2.53 mg/mL;;而竹蓀和竹蓀菌托提取物對α-淀粉酶(15.15%和24.56%)和α-葡萄糖苷酶(26.20%和23.41%)的活性抑制率較低,且IC50值均超出實驗濃度。實驗結果得出,茶樹菇提取物的降血糖作用和抗氧化作用均較強,松乳菇提取物的降血糖作用較強抗氧化作用較弱,而竹蓀和竹蓀菌托提取物的抗氧化活性和降血糖活性均較弱,具體藥物作用機制有待進一步研究。竹蓀及副產物提取物的其他生物活性還有待進一步考察。