黑菊芋水提液對便秘小鼠潤腸通便作用的研究

姬妍茹,張正海,楊慶麗,滕春波,石 杰,董 艷,魏連會,高 媛,潘 靜

(1.黑龍江省科學院大慶分院,黑龍江大慶 163319;2.東北林業大學生命科學學院,黑龍江哈爾濱 150040)

菊芋(HelianthustuberosusL)又名洋姜(Jerusalem artichoke),是菊科向日葵屬唯一能夠形成地下塊莖的草本植物,原產自北美洲[1],十七世紀傳入歐洲,后傳入中國,主要食用部位為塊莖,塊莖中水分占比為80%左右,其次為17.0%左右的碳水化合物,碳水化合物中最主要的成分是菊糖,約占55%～83%[2]。菊糖具有雙向調控血糖、改善腸道和防治便秘等功能[3]。菊芋菊糖主要成分為果聚糖,是已知的唯一一種被科學論證過的符合益生元定義的可食用性不被消化多糖[4-5],李琬聰[6]研究發現菊糖的生物活性與聚合度之間遵循“低聚合度活性高”的規律,以三聚和四聚菊糖活性最佳,聚合度大于五的菊糖益生活性減弱,但五聚到八聚菊糖之間的活性差異不顯著。低聚果糖通常指蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合物,食用后,不被胃和小腸消化吸收,可被大腸內的益生菌利用,增加大腸內糞便的含水量及膨化能力,產生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸(SCFA)[7],起到抑制沙門氏菌等致病菌生長,刺激腸蠕動,凈化腸道環境,增強胃腸功能,預防和緩解便秘的作用[8-9]。鮮菊芋以腌制醬菜為主,口感脆硬無特別味道,經變溫工藝加工后,顏色變為黑褐色(因此稱之為黑菊芋),水分含量顯著減少,酸度升高,糖類、氨基酸和揮發性成分的種類和含量均產生變化,其中尤以糖類變化最大。果聚糖逐漸分解為單糖、雙糖和低聚果糖等小分子糖類物質,還原糖含量顯著上升,占40%以上,是鮮菊芋的幾十倍,賦予黑菊芋酸甜軟彈的口感[10]。

便秘是一種常見的腸道疾病,發病率較高,在全世界的平均發病率為16%,我國發病率為20%～30%[11],且有逐年上升的趨勢。該病的特點是結腸傳輸功能低下,內容物在腸腔傳輸緩慢,臨床表現為排便困難、次數減少、糞便干硬、便意減弱甚至消失,同時伴有腹痛、腹脹[12-13]。個體的便秘癥狀差異較大,目前臨床上主要以緩解排便困難,恢復腸道動力為治療目標,應用的藥物以西藥瀉劑為主,短期內效果明顯,但長期服用易產生藥物依賴,出現腹脹、維生素吸收障礙等副反應[14]。便秘的發生一般伴隨著腸道動力及菌群失調,具有益生元功能的食物可以有效緩解或者改善癥狀。很多源于植物或大型真菌的天然碳水化合物被證實具有潛在的益生元功能[15-16],鮮菊芋富含菊糖和膳食纖維,具有調節腸道菌群、預防便秘的功效,加工成黑菊芋后,口感上易于為消費者接受,但其多糖組成發生改變,是否會影響原有功效,值得去深入探討。

本研究以水為溶劑獲得黑菊芋提取液,對其進行多糖組成分析。同時以KM小鼠為研究對象,建立復方地芬諾酯便秘小鼠模型,探討黑菊芋水提液對便秘小鼠腸推進運動和排便功能的影響,為揭示黑菊芋的保健功效提供數據佐證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊芋 “慶芋2號”品種,收獲于黑龍江省大慶市星火牧場;黑菊芋 以“慶芋2號”品種菊芋塊莖為原料,利用黑龍江省科學院大慶分院自制設備生產;復方地芬諾酯 長春長紅制藥有限公司;酚酞片 山西亨瑞達制藥有限公司;小鼠飼料 北京科澳協力飼料有限公司;墨汁 北京一得閣墨業有限責任公司;乙酸、丙酸、丁酸、戊酸 色譜純,德國Dr. Ehrenstorfer公司；果糖、葡萄糖、蔗糖 色譜純,北京中科儀友化工研究院;SPF級健康雌性KM小鼠 體重20～22 g,購于長春市億斯實驗動物技術有限公司(許可證號:SCXK(吉)-2018-0007)。

Master-D UF型超純水機 上海和泰儀器有限公司;LDZX-40SCI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療儀器廠;GT10-1型高速離心機 北京時代北利離心機有限公司;VFD-4500型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;GCMS ISQ LT氣相色譜質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;Epoch酶標儀 美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮菊芋和黑菊芋水提液的制備 黑菊芋的制備:以鮮菊芋塊莖為原料加工而成,方法見參考文獻[17]。水提液的制備[6]:將鮮菊芋和黑菊芋切成厚度約1.5 cm左右的片后,分別稱取200 g,加入5倍的蒸餾水浸泡過夜,勻漿后80 ℃,150 W功率超聲30 min,六層紗布過濾,濾液凍干,加入蒸餾水復溶并定容至200 mL,冰箱冷凍保存,準備用于腸推進實驗和排便實驗。

1.2.2 提取液多糖檢測 菊糖含量檢測采用總糖減去還原糖的方法[18]。總糖測定采用苯酚-硫酸法[19],還原糖含量測定采用DNS法[6],以果糖計;果糖、葡萄糖和蔗糖含量的測定參照國標的方法[20],分別以果糖、葡萄糖和蔗糖標準品濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。色譜柱:Agilent ZORBAX NH2柱(5.0 μm×4.6 mm×150 mm);流動相為乙腈-水(70∶30),等度洗脫,流速為1.0 mL/min;進樣量1.0 μL;柱溫30 ℃。檢測器為蒸發光散射檢測器(ELSD),漂移管溫度80～90 ℃,氮氣壓力350 kPa;撞擊器:關。果糖標準曲線方程為:Y=2221.4X+310.7,R2=0.9993;葡萄糖標準曲線方程為:Y=1944.9X+472.4,R2=0.9997;蔗糖標準曲線方程為:Y=2597.7X+222.0,R2=0.9993。

1.2.3 腸推進實驗設計 參照保健食品檢驗與評價技術規范(2003版)中關于通便功能檢驗的方法進行。環境條件為(25±2) ℃溫度、50%±5%濕度、自由取食進水。健康KM雌性小鼠54只,適應性飼養5 d后,稱量小鼠體重,隨機分為9組,每組6只。除空白對照組(CK)灌胃無菌生理鹽水,其余8組給予10 mg/kg bw復方地芬諾酯建立小鼠便秘模型。灌胃30 min后,CK組和模型對照組(MC)只灌胃生理鹽水;陽性對照組(AC)給予含20.0 mg/kg bw的酚酞懸濁液;鮮菊芋和黑菊芋干預組,給予相當于正常人(60 kg)日食用30 g鮮菊芋和黑菊芋的量,設低、中、高劑量組,鮮菊芋低、中、高劑量組分別用RL、RM、RH表示,黑菊芋低、中、高劑量組分別用BL、BM和BH表示,對應給藥量為2.5、5.0、10.0 g/kg bw,給藥劑量為0.2 mL/10 g bw。連續灌胃7 d后,各組禁食不禁水16 h,稱量小鼠體重,然后CK組灌胃無菌生理鹽水,其余8組給予10 mg/kg bw復方地芬諾酯,30 min后,各組分別灌胃含相應受試物的墨汁,25 min后脫頸椎處死小鼠,取出自幽門至回盲部的整段小腸,測量小腸全長和墨汁前沿在小腸內推進的距離,計算墨汁推進率。

1.2.4 小鼠排便實驗 參照《保健食品檢驗與評價技術規范(2003版)》中關于通便功能檢驗的方法進行。實驗設計同腸推進實驗,小鼠單籠飼養,正常飲食和進水。從灌胃墨汁開始計時,記錄每只小鼠首次排出黑便的時間、6 h內排出黑便的粒數及質量,觀察并收集糞便,迅速于-80 ℃冰箱冷凍,用于短鏈脂肪酸(SCFAs)含量的檢測。

1.2.5 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量的測定 采用氣相色譜質譜聯用方法(Gas Chromatograph Mass Spectrometer,GC-MS)進行檢測。

樣品前處理:取0.3 g糞便樣品加入2.0 mL磷酸水溶液(1∶3),渦旋勻漿2 min,加入1.0 mL乙醚萃取10 min,0 ℃條件下,4000 r/min離心20 min,取上清;再加入1.0 mL乙醚萃取10 min,以同樣條件再次離心20 min;將兩次萃取液合并揮發至1.0 mL以內,進樣分析。

分別以乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸和正戊酸標準品濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

色譜條件(GC):色譜柱為TG WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣器溫度:240 ℃;程序升溫:初始溫度100 ℃,保持5 min,隨后以5 ℃/min的速率升溫到150 ℃,再以30 ℃/min的速率升溫到240 ℃,保持30 min;載氣(Ne),流量為1.0 mL/min;分流比為75∶1;進樣量為10 μL。

質譜條件(MS):EI源轟擊電壓:70 eV,單離子掃描模式:定量離子60、73,離子源溫度:200 ℃,連接線溫度:250 ℃。

乙酸的標準曲線方程為:y=213687.5832x-492.9102,R2=0.9999;丙酸的標準曲線方程為:y=117413.8232x-1808.1544,R2=1.0000;異丁酸的標準曲線方程為:y=226423.6296x-4004.5454,R2=1.0000;正丁酸的標準曲線方程為:y=779726.6220x-3154.8745,R2=1.0000;異戊酸的標準曲線方程為:y=680468.4445x-8606.3205,R2=1.0000;正戊酸的標準曲線方程為:y=958627.3557x-1624.8999,R2=1.0000。

1.3 數據處理

本文中每個處理為6次重復,表格數據表示為平均值±標準誤(Means±Sem),組間顯著性差異由單因素方差分析(One-way ANOVA),并進行Turkey事后檢驗,顯著性差異分析由DPS V7.05軟件進行,P<0.05時認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 水提液多糖含量對比

由圖1可知,兩種提取液相比,黑菊芋的總糖含量極顯著高于鮮菊芋(P<0.01)。鮮菊芋和黑菊芋提取液中菊糖含量分別為17.5926和19.4156 g/100 g。鮮菊芋提取液中果糖、葡萄糖和蔗糖含量分別為1.4166、0.3439和1.7668 g/100 g,黑菊芋提取液中果糖、葡萄糖和蔗糖含量分別為10.7332、1.2179和6.2206 g/100 g,兩者相比,黑菊芋提取液中菊糖、果糖、葡萄糖和蔗糖的含量均顯著高于鮮菊芋(P<0.01),原因是菊芋加工過程中部分菊糖經熱降解生成單糖、二糖,最后干燥過程又失去大量水分[10]。果糖、葡萄糖和蔗糖的增加賦予黑菊芋香甜的口感,適口性更好。菊糖是已知的益生元,以此兩種提取液飼喂便秘小鼠,對改善其便秘癥狀可能會有所助益。

圖1 水提液主要糖分含量

2.2 黑菊芋水提液對小鼠體重變化的影響

由圖2 可知,與CK相比,MC、AC和RL處理組小鼠的體重變化值略有上升,BL、BM和BH組略有下降,但是鮮菊芋和黑菊芋各處理組與CK、MC和AC組之間均無顯著性差異(P>0.05),表明攝入鮮菊芋和黑菊芋提取液對小鼠體重變化無不良影響。黑菊芋提取液中果糖、葡萄糖和蔗糖含量雖然較鮮菊芋顯著增加,適口性增強,但每天給予2.5～10.0 g/kg bw的黑菊芋,不會引起小鼠體重的顯著增長。

圖2 不同處理組小鼠實驗前后體重變化

2.3 黑菊芋水提液對小鼠腸推進功能的影響

由圖3可知,MC組小鼠的墨汁推進率顯著低于空白對照組小鼠(P<0.05),即小鼠腸蠕動抑制模型成立。鮮菊芋和黑菊芋各組小鼠的墨汁推進率均顯著高于MC組(P<0.05),RL、RM和RH組分別高出57.96%、69.73%、82.25%,BL、BM和BH組分別高出60.57%、70.59%、101.02%,而且RM、RH、BM和BH組小鼠小腸墨汁推進率與AC組差異不顯著(P>0.05)。

圖3 黑菊芋水提液對小腸墨汁推進率的影響

2.4 黑菊芋水提液對小鼠排便功能的影響

由圖4可見,與CK組小鼠相比,MC組小鼠首粒黑便時間顯著推遲(P<0.05),排便粒數及排便質量顯著降低(P<0.05),表明便秘模型建立成功。與AC組相比,RM、RH、BM和BH劑量組小鼠的首粒黑便時間、排便粒數和排便質量結果差異不顯著(P>0.05);與MC組相比,除BM的首粒黑便時間無顯著差異外(P>0.05),其他結果均具有顯著差異(P<0.05)。BM組小鼠的首粒黑便時間提前了24.57%,排便粒數和質量分別增加了67.64%和87.31%;BH組小鼠的首粒黑便時間提前了35.56%,排便粒數和質量分別增加了85.29%和67.26%。與RM組相比,BM組小鼠的首粒黑便時間延遲、排便粒數和糞便質量略有增加,但差異不顯著(P>0.05);與RH組相比,BH組亦呈現首粒黑便時間延遲、排便粒數和糞便質量增加的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同處理組小鼠排便功能比較

2.5 黑菊芋水提液對小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

短鏈脂肪酸(SCFAs)是人和其它哺乳動物重要的體內代謝能源,不能進行內源性合成。主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸等,乙酸、丙酸和丁酸約占SCFAs總量的90%～95%,源于腸道菌群對非消化性碳水化合物的發酵作用,異丁酸與異戊酸通常源于致腐微生物對蛋白質的發酵作用。乙酸主要參與大腦、心臟、腎臟和體內肌肉的代謝;丙酸可以抑制肝膽固醇的合成,降低血清中膽固醇水平[21-24];丁酸具有保護腸黏膜、抗炎、增強胃腸機能,抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化和凋亡的作用[25-27]。

由表1可見,MC組與CK組相比,SCFAs總量顯著降低(P<0.01),但與AC組無顯著差異(P>0.05)。Mazzawi等[28]發現便秘型腸易激綜合癥(IBS)患者的糞便中SCFAs降低,史益凡研究表明,頑固性便秘患者糞便中SCFAs的含量顯著減少,便秘程度越重,SCFAs的含量就越低,同時以各種瀉藥干預便秘小鼠,對其糞便中的SCFAs含量無顯著影響[29]。本研究中,MC小鼠糞便的SCFAs總量顯著降低,給予酚酞片的AC組的SCFAs總量與MC相比,沒有得到改善,在這一點上與文獻結果是一致的。

表1 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量

黑菊芋中、高劑量組的SCFAs總量顯著高于MC組和AC組(P<0.01),但中劑量組低于CK組,含量順序為RH>BH>CK>BM>RM>BL>RL>MC>AC,各組中SCFAs的平均含量分別為5.1196、4.895、4.8227、4.1858、3.8495、3.7065、3.5984、2.8281、2.6773 mg/g。不同菊芋處理組的SCFAs構成存在一定差異,與MC組相比,乙酸含量方面,鮮菊芋和黑菊芋的低劑量組差異均不顯著(P>0.05),中、高劑量組顯著升高(P<0.05或P<0.01),以RH組最高,BH和BM組次之;丙酸含量方面,只有黑菊芋中、高劑量組與MC組有顯著差異(P<0.05或P<0.01);與MC組相比,正丁酸含量方面,黑菊芋各組與鮮菊芋高劑量組顯著升高(P<0.01);正戊酸含量方面,BL、BH組顯著高于MC組(P<0.05或P<0.01);異戊酸含量方面,只有BL組顯著高于MC組(P<0.01);各組的異丁酸含量與MC組無顯著差異(P>0.05)。總體看來,給便秘小鼠灌胃適量鮮菊芋和黑菊芋水提液,可以有效促進小鼠腸道代謝產生乙酸、丙酸和正丁酸,效果明顯好于灌胃酚酞片懸濁液,原因是酚酞片治療便秘的機理是在堿性腸液作用下分解形成可溶性鈉鹽,通過刺激腸壁神經,增強腸蠕動來緩解便秘,并不能調整菌群生長[30],因而不會增加腸道內SCFAs含量[29]。灌胃黑菊芋提取液的效果略好于鮮菊芋。這可能與黑菊芋提取液中菊糖含量略高于鮮菊芋,可以有效促進益生菌在盲腸中的增殖有關。

3 結論

黑菊芋提取液中多糖組成以菊糖、果糖、葡萄糖和蔗糖為主,含量分別為19.4156、10.7332、1.2179和6.2206 g/100 g。灌胃5.0和10.0 g/kg bw黑菊芋水提液,可以有效促進便秘小鼠的腸道蠕動,增強排便功能,促進便秘小鼠腸道代謝產生乙酸、丙酸和丁酸,提高腸道中短鏈脂肪酸的總量,改善腸道環境,緩解便秘,其效果與20.0 mg/kg bw酚酞片的效果相當,與相對應劑量的鮮菊芋之間無顯著差異。根據保健食品檢驗與評價技術規范中排便功能評價方法中的判定標準,可認為黑菊芋水提液具有潤腸通便的功能。本研究為黑菊芋的保健功效提供了依據,但動物實驗結果與人體實驗還存在著一定的差別,黑菊芋在人體內能否發揮同樣的功效,對腸道菌群是否具有良好的調節作用,還需要進一步的實驗驗證。