堿蓬多糖SSP1-1的分離純化及其抗腫瘤活性

李晶晶,劉欣鑫,薛 陽,崔 鏨,*

(1.錦州醫科大學附屬第一醫院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫科大學醫療學院,遼寧錦州 121000)

堿蓬(Suaedasalsa)是一種黎科植物,又名翅堿蓬,為一年生葉肉質化草本植物。堿蓬營養價值豐富,其中含有各種有助于人類健康的成分,例如脂肪酸、黃酮、色素、蛋白質和無機鹽等生物大分子[1]。由于其經濟作用和研發價值前景廣闊,堿蓬的研究和開發在許多領域備受矚目。多糖是動物、植物和微生物生長過程中必不可少的一種生物大分子。通常是由10個以上相同或者不同的單糖分子通過糖苷鍵縮聚而成的高分子聚合物[2]。天然多糖的生物活性十分廣泛,如免疫調節、降血糖、抗氧化和抗腫瘤等,此外,天然多糖還具有藥理穩定性和低毒性等優點,這些優勢使其在食品和藥物開發中占據首要地位。隨著社會的進步,推進了科學研究的發展,多糖生物功效多樣性的研究受到國內外廣泛關注。

腫瘤是由正常細胞的異常生長和擴張引起的高發病率和高死亡率的疾病。近幾年,我國腫瘤的發病率逐步上升,嚴重地威脅了人們的生活和健康[3]。目前,手術治療與化療是治療腫瘤的主要途徑,但是手術治療風險高,化療藥物通常會引起患者惡心嘔吐、免疫損傷等嚴重的副作用。因此,開發一種不良反應小,治療效果好的天然抗腫瘤藥物勢在必行。目前,對堿蓬多糖的分離純化已見報道,但對于其生物活性的研究主要集中在抗氧化和免疫活性等方面。王昭晶[4]從堿蓬中提取出兩組均一組分多糖SPA和SPB,并證明其有超氧陰離子清除作用和羥自由基清除作用;龐庭才等[5]通過NaOH溶液提取堿蓬多糖,并對其抗氧化活性進行探討。劉素華等[6]利用熱浸提法提取堿蓬多糖,得到的多糖平均分子量為2.52×106Da;并證明堿蓬多糖具有良好的體外抗氧化活性,以上研究中,僅對堿蓬多糖體外抗氧化活性相關內容進行了初步研究,未對堿蓬多糖抗腫瘤活性進行相關研究。本文以堿蓬為原料,通過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱得到一種均一且分子量明確的堿蓬多糖SSP1-1,并利用MTT、Hoechst 33342染色、Western blot方法對該多糖的抗人肝癌細胞HepG2活性進行研究,以期為堿蓬多糖的開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿蓬 遼寧省錦州市凌海大橋下沿海灘涂濕地,經錦州醫科大學附屬第一醫院韓冠英教授鑒定為堿蓬屬堿蓬草;HepG2細胞、L-02細胞 中國科學院上海細胞庫;胎牛血清、DMEM細胞培養基、胰酶和PBS Gibico公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、Hoechst 33342染色液、RIPA裂解液 Beyotime公司;DEAE-52纖維素柱、Sephadex G-75葡聚糖凝膠色譜柱 GE Healthcare公司;T系列不同分子量的葡聚糖標準品(T-5,T-10,T-50,T-70 和T-500,純度≥98%) 上海原葉生物科技有限公司;濃硫酸、95%乙醇、濃鹽酸和苯酚等試劑 均為國產分析純。

真空冷凍干燥機、BS-100A自動部份收集器 上海一恒公司;680型全自動酶標儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿蓬粗多糖的制備 稱取粉碎后的堿蓬粗粉50 g,加入300 mL的80%乙醇回流脫脂2次,每次2 h,過濾取沉淀物,置于烘箱內45 ℃烘干。取烘干后的堿蓬粉末,加入500 mL純化水于80 ℃水浴鍋中加熱回流提取2次,每次3 h。收集濾液并在60 ℃下減壓濃縮,離心(3000 r/min,15 min)后取上清液;利用活性炭吸附法進行脫色,Sevage法脫蛋白,在溶液中加入3倍量的50%乙醇溶液,4 ℃下放置24 h,離心(3000 r/min,20 min)取沉淀;用乙醇和丙酮將沉淀物洗滌干凈后進行冷凍干燥,得堿蓬粗多糖[7]。

1.2.2 堿蓬粗多糖的分離純化 取200 mg堿蓬粗多糖溶于100 mL純化水中,溶解,過0.45 μm微孔濾膜。將處理后的樣品加載到DEAE-52纖維素離子交換柱上,分別配制0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L NaCl溶液作為洗脫溶液進行洗脫,流速為1 mL/min,每10 mL收集一管。邊收集邊利用苯酚-硫酸法跟蹤檢測收集液的OD490,收集單一組分,冷凍干燥,用于進一步分離純化。取上述實驗步驟中的單一組分100 mg溶于100 mL雙蒸水中,溶解,過0.45 μm微孔濾膜,將處理好的樣品加載到Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱,用蒸餾水進行洗脫,流速為0.5 mL/min,每5 mL收集一管。檢測方法同上,收集單一洗脫峰、濃縮、冷凍干燥,得到單一組分堿蓬多糖。

1.2.3 堿蓬多糖分子量及純度鑒定 通過高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對堿蓬多糖的分子量及純度進行鑒定,使用TSK-gel G3000PWxl(7.5 mm×300 mm)柱和Agilent-LC 1200體系,配備折射率檢測器(RID)[8]。取單一堿蓬多糖溶解于蒸餾水中,配成初始濃度為1.5 mg/mL的溶液,過0.45 μm微孔濾膜,進樣量為20 μL,流動相為0.05 mol/L NaCl,流速為0.5 mL/min。T系列不同分子量的葡聚糖標準品(T-5,T-10,T-50,T-70和T-500)配制成濃度為1.5 mg/mL的標準溶液,按上述相同方法進行檢測。以色譜峰的保留時間(Rt)為橫坐標,葡聚糖標準品的平均分子量的對數值(logMw)為縱坐標進行線性回歸。

1.2.4 細胞培養 將HepG2細胞和L-02細胞分別在DMEM完全培養液中培養(含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素50 μg/mL),并將細胞放置在在37 ℃、飽和濕度、含5% CO2的孵育箱中培養24 h,將處于對數生長期的HepG2細胞和L-02細胞用于下面的體外實驗研究。

1.2.5 堿蓬多糖對腫瘤細胞的抑制作用 將對數生長期的細胞用胰酶消化下來,加入配置好的培養基使細胞懸浮,吹打均勻。分別將HepG2細胞和L-02細胞以1×104cell/mL的密度接種到96孔培養板中[9]。置于CO2恒溫培養箱24 h后加入不同濃度的堿蓬多糖SSP1-1(終濃度為 0、50、100、200、300和500 μg/mL),分別培養24和48 h后,加入0.5 mg/mL的MTT,每孔20 μL,4 h后吸出上清液,并每孔加入200 μL DMSO,避光振蕩20 min,通過酶標儀檢測570 nm處的吸光值,計算細胞活力。計算公式如下:

1.2.6 Hoechst 33342細胞染色 通過細胞計數,將HepG2細胞的密度調整為5×104cell/mL,接種到24孔板中,每孔加入不同濃度的SSP1-1(0、100、200和500 μg/mL),放入培養箱孵育24 h,用PBS清洗2次后用核染料Hoechst 33342染色,熒光顯微鏡觀察細胞核的形態。

1.2.7 Western blot實驗 利用培養皿培養細胞,待細胞長到80%后加入不同濃度的SSP1-1(終濃度為0、100、200和500 μg/mL),培養24 h后收集細胞。利用BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度。將上樣緩沖液在沸水中加熱10 min使細胞蛋白質變性。將20 μL蛋白質樣品加載到SDS-PAGE凝膠上并轉移到0.45 μm PVDF膜上[10]。隨后,用1% BSA溶液在室溫下封閉2 h,將PVDF膜在4 ℃下與相應的一抗(一抗工作濃度1∶1000)孵育24 h,TBST洗滌3次,在室溫下與相應的二抗(二抗工作濃度1∶10000)孵育2 h,浸入配好的ECL顯影液中,隨后取出曝光檢測。

1.3 數據處理

使用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05表明統計學具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 堿蓬粗多糖的分離純化及純度鑒定

本實驗通過水提醇沉提取法得到堿蓬粗多糖SSP,通過DEAE-52纖維素色譜柱分離粗多糖SSP,得到兩個洗脫組分,其中水洗脫部分命名為SSP1,0.2 mol/L NaCl洗脫部分命名為SSP2,洗脫曲線見圖1。本課題組在之前的實驗中已經對SSP2進行研究[7],因此本實驗將對SSP1進行研究,SSP1經Sephadex G-75葡聚糖凝膠過濾色譜法進一步純化,得到單一洗脫組分SSP1-1,洗脫曲線如圖2所示,收集組分SSP1-1并用于后續實驗的分析。

圖1 DEAE-52纖維素交換柱洗脫曲線

圖2 Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱洗脫曲線

以多糖標準品分子量的對數值對保留時間繪制標準曲線,得到線性回歸方程為logMw=-0.2344Rt+6.7682,R2=0.9994。堿蓬多糖分子量色譜圖如圖3所示,由于高效凝膠滲透色法(HPGPC)測量多糖純度和分子量的靈敏度高,可靠性大[11-12],所以SSP1-1組分為單一對稱峰,表明SSP1-1為均一多糖,保留時間為8.48 min,通過線性回歸方程計算其分子量為60.32 kDa。

圖3 堿蓬多糖分子量測定色譜圖

2.2 堿蓬多糖對腫瘤細胞的抑制作用

通過MTT測定SSP1-1對HepG2細胞的細胞活力的影響。從圖4A可以看出,HepG2細胞活力隨著SSP1-1濃度的增加逐漸下降(P<0.05)。當濃度為500 μg/mL時,HepG2細胞在24 h和48 h的細胞活力分別為52.8%和50.2%。這個結果表明,相同濃度的SSP1-1對HepG2細胞的抑制作用會隨著作用時間的延長而逐漸增強。從圖4B可以看出,在用SSP1-1處理24 h后,L-02細胞的活力基本不受影響。此外,當SSP1-1濃度大于100 μg/mL時,HepG2和L-02細胞的活力明顯不同。綜上所述,SSP1-1通過濃度和時間依賴性的方式抑制HepG2細胞的增殖,并且對正常細胞L-02的增殖沒有影響。

圖4 細胞活力檢測

2.3 SSP1-1誘導腫瘤細胞形態學改變

為了進一步鑒定SSP1-1對HepG2細胞的生長抑制作用是否與誘導凋亡有關,對細胞形態學特征進行研究。將經不同濃度的SSP1-1處理的HepG2細胞利用熒光染料Hoechst 33342進行染色,在熒光顯微鏡下觀察HepG2細胞核的形態。從圖5可以看出,隨著SSP1-1濃度的增加,細胞核的形態變化逐漸明顯。對照組的細胞核一般為均勻的橢圓形狀,在分別用濃度為100、200、500 μg/mL的SSP1-1處理HepG2細胞后,隨著濃度的增加細胞受損程度逐漸嚴重并觀察到典型的核凋亡形態。在濃度為100 μg/mL時,可見細胞核皺縮,在濃度為200 μg/mL時,細胞核皺縮數量增加,形態變化更加明顯,在濃度為500 μg/mL時,細胞核出現碎裂,這可能與多糖具有引起腫瘤細胞核皺縮,染色質壓縮和核碎裂成小圓體等作用有關[13]。

圖5 Hoechst 33342染色圖(×200)

2.4 Western blot實驗

通過Western blot法檢測SSP1-1通過何種途徑誘導HepG2細胞發生凋亡。隨著Bcl-2、Bax和Caspase-3在細胞凋亡信號傳導過程中關系研究的進一步深入,發現Bcl-2、Bax不但可以作為Caspase-3上游調控機制,參與對Caspase-3活性的調節,還可以作為Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3的下游,二者在細胞凋亡過程中相互聯系又相互制約[14]。因此,本文對Bax、Bcl-2和Caspase-3等蛋白表達情況進行檢測。如圖6所示,隨著SSP1-1濃度的增加,Bax的表達水平逐漸升高,Bcl-2的表達水平逐漸降低,Caspase-3的表達進一步增強,同時發現3種蛋白的表達均呈劑量依賴性(P<0.05)。

圖6 Western Blot實驗結果

3 討論與結論

本文利用水提醇沉法提取出堿蓬粗多糖SSP,通過DEAE-52纖維素色譜柱和Sephadex G-75葡聚糖凝膠色譜柱得到一種水溶性多糖SSP1-1,分子量為60.32 kDa。研究表明植物多糖對人肝癌HepG2細胞的增殖具有明顯的抑制作用,王景春等[15]通過水提醇沉法提取出川芎多糖,并證明川芎多糖對HepG2細胞有明顯的體外活性抑制作用,并推測其是通過將腫瘤細胞阻滯在G1期從而誘導其凋亡;張多強等[16]證明枸杞多糖可抑制HepG2細胞增殖并同時誘導腫瘤細胞自噬。綜上所述,植物多糖可以抑制HepG2細胞的增殖,并隨著濃度的增加呈劑量依賴性。本實驗通過對SSP1-1進行抗腫瘤活性驗證,發現SSP1-1具有抑制HepG2腫瘤細胞增殖作用并對正常細胞L-02毒性較低,具有在治療過程中的減少副作用的潛力。

MTT比色法可以反映出活細胞的數量,利用酶標儀檢測560 nm處96孔板中細胞的吸光度值,來檢測細胞的生存活力[17]。本實驗通過MTT法測定SSP1-1對HepG2細胞生存活力的影響,結果表明SSP1-1呈劑量時間依賴性的抑制HepG2細胞的增殖,并且對人體正常肝細胞系L-02的增殖無明顯影響,可以說明SSP1-1具有抗腫瘤活性,并不影響正常細胞的增殖。此外,通過觀察經Hoechst 33342染色后的HepG2細胞核的形態變化,可以看到經過SSP1-1誘導處理的HepG2細胞的細胞核具有典型的凋亡形態。通過檢查Bcl-2和Caspase基因家族編碼的蛋白質的表達,是確定細胞是否凋亡的主要指標[18]。Bax、Bcl-2共屬于Bcl-2基因家族,Bax基因在人體凋亡基因中起到關鍵性作用,Bax在促進細胞凋亡的同時還可以拮抗Bcl-2的抑制細胞凋亡[19-21],Bcl-2家族蛋白質分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白,是調節線粒體途徑的關鍵蛋白。促凋亡成員和抗凋亡成員兩者之間的表達水平的平衡直接影響細胞存活或細胞凋亡[22-24]。因此,確定細胞是否發生凋亡的重要指標是檢測Bax與Bcl-2兩蛋白之間的比值。此外,Caspase-3蛋白酶存在于細胞質中,參與細胞的生長、分化與凋亡調節,作為關鍵介質調節程序性細胞凋亡,在細胞凋亡信號通路中起關鍵作用[25]。Western blot實驗結果顯示,SSP1-1在抑制Bcl-2的表達的同時還可以增加Bax的表達,并以劑量依賴的方式激活Caspase-3的表達,進一步證實SSP1-1可誘導HepG2細胞凋亡。

多糖抗腫瘤活性已成為近幾年多糖研究領域的熱點問題。多糖物質直接抑制腫瘤細胞的途徑包括:促進腫瘤細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞生長周期等機制發揮作用。此外,多糖還可以增強機體免疫力,作為一種免疫增強劑發揮抑制腫瘤作用。多糖作為一種具有抗腫瘤潛力的功能物質之一,具有較高的研究價值。本文對SSP1-1的相關研究,可為開發一種天然的多糖類抗腫瘤藥物或功能性食品提供理論依據。