副干酪乳桿菌K56調(diào)節(jié)腸道菌群及潤腸通便功能研究

劉偉賢,郝婧宇,陳希民,冷候喜,王 鑫,李 東,趙 雯,趙子夫,*,洪維鍊

(1.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司,內(nèi)蒙古呼和浩特010110;2.北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069;3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110)

副干酪乳桿菌是一種革蘭氏陽性異型發(fā)酵乳酸菌,是一種兼性厭氧、不運(yùn)動(dòng)、無芽孢的桿菌或長桿菌,是乳桿菌屬的重要成員,廣泛存在于人類口腔、腸道、發(fā)酵乳制品(尤其是奶酪)和植物原料發(fā)酵物(泡菜、酒和飼料)中[1]。在功能研究中,副干酪乳桿菌具有乳桿菌屬共性作用,如攝入副干酪乳桿菌代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、細(xì)菌素和苯乳酸[2-3]等,能夠有效的抑制致病菌和腐敗菌的生長;調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌,促炎細(xì)胞因子活性降低,從而降低腸易激綜合征免疫激活的作用[4-5]。同時(shí),副干酪乳桿菌通過胞外酶的作用分解蛋白產(chǎn)生小分子肽,在降血壓、抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇[6-9]等方面發(fā)揮著重要作用。副干酪乳桿菌通過發(fā)酵過程,不斷影響食品的品質(zhì)和風(fēng)味,產(chǎn)生有益物質(zhì),如抗氧化肽[10],提高多酚和抗氧化活性,減少生物胺[11],抑制黃曲霉毒素[12]等,主要用于干酪和酸奶,在肉制品的應(yīng)用研究中也有少量報(bào)道。

近幾年,國內(nèi)外開展多項(xiàng)副干酪乳桿菌作用研究,主要集中于調(diào)節(jié)腸道菌群及緩解便秘[13-19],其他功效如副干酪乳桿菌NTU101乙醇提取物可抵抗牙周炎[20],PS23延緩衰老小鼠認(rèn)知下降[21],CNCMI-4034調(diào)節(jié)沙門氏菌誘導(dǎo)的炎癥作用[22]等已有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。目前,副干酪乳桿菌部分菌株聯(lián)合其他益生菌在臨床中已有使用[23-28],在食品中的應(yīng)用主要集中于功能功能乳品的添加[29-30]。

副干酪乳桿菌在消化系統(tǒng)中定植,對(duì)腸道健康產(chǎn)生直接影響,進(jìn)而對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生影響,因此菌株對(duì)腸道的作用為其首要研究內(nèi)容。本研究以分離鑒定副干酪乳桿菌菌株K56為研究對(duì)象,參考保健食品功能評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)、排便實(shí)驗(yàn)及腸道菌群增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)副干酪乳桿菌K56菌株的通便效果和腸道健康調(diào)節(jié)效果進(jìn)行研究,為后續(xù)的深入研究和食品中的添加提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌K56菌株凍干粉(實(shí)驗(yàn)室檢測菌株規(guī)格為1.5×1011CFU/g) 內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司;伊紅美藍(lán)瓊脂、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂、BBL瓊脂、Lbs瓊脂、TSC瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;成年Balb-c小鼠 280只,體重(22.0±2.0) g,北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2014-0004),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境飼養(yǎng)(飼養(yǎng)許可證號(hào):SYXK(京)2014-0047)。

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;XS1003S型電子天平 瑞典Mettler Toledo公司;DIGITAL S菌落計(jì)數(shù)儀 杭州迅數(shù)科技有限公司;HH.CP-TW(80L)二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 上海申賢恒溫設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混懸液制備 蒸餾水滅菌,稱適量副干酪乳桿菌K56凍干菌粉溶于100 mL滅菌蒸餾水制備成溶液,十倍梯度依次稀釋為5個(gè)劑量混懸液,配制為0.00433、0.0433、0.433、4.33、43.33 mg/100 mL溶液。

1.2.2 劑量設(shè)置 設(shè)置0.000867、0.00867、0.0867、0.867、8.67 mg/kg作為實(shí)驗(yàn)極低、低、中、高、極高劑量組動(dòng)物劑量,根據(jù)小鼠與人體體表面積換算分別對(duì)應(yīng)人體每日攝入量為1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/d,調(diào)節(jié)腸道菌群實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組,小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和排便實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和模型組,均以滅菌蒸餾水作為對(duì)照,劑量為20 mL/kg。

1.2.3 調(diào)節(jié)腸道菌群功能實(shí)驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)及評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢驗(yàn)相關(guān)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn),84只Balb/c小鼠于屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,按照體重隨機(jī)分為6組,每組14只。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水?dāng)z食,灌胃給予受試物14 d。給予受試物前及灌胃14 d后,無菌采取小鼠糞便2～3粒,分別使用BBL瓊脂、Lbs瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂和TSC瓊脂平板檢測[20]糞便中雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌檢含量,結(jié)果以單位質(zhì)量糞便菌落形成單位的對(duì)數(shù)值表示(lg CFU/g)。

1.2.4 小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)及評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中潤腸通便功能檢驗(yàn)相關(guān)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn),98只Balb/c小鼠于屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,體重[(22.0±2.0) g],按照體重隨機(jī)分為7組,每組14只,實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水?dāng)z食。灌胃干預(yù)30 d后,各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對(duì)照組和各干預(yù)組給予0.04%(m/V)鹽酸洛哌丁胺溶液,正常對(duì)照組給予蒸餾水(劑量為20 mL/kg)30 min后,各干預(yù)組小鼠灌胃含相應(yīng)劑量受試物的阿拉伯膠墨汁懸液,正常對(duì)照組給予空白阿拉伯膠墨汁(劑量為20 mL/kg)。25 min后,頸椎脫臼處死動(dòng)物,解剖分離動(dòng)物腸道,剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管,輕輕將小腸拉成直線,測量腸管長度為小腸總長度,從幽門至墨汁前沿為墨汁推進(jìn)長度,計(jì)算墨汁推進(jìn)率:

墨汁推進(jìn)率(%)=墨汁推進(jìn)長度(cm)/小腸總長度(cm)×100

1.2.5 排便實(shí)驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)及評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中潤腸通便功能檢驗(yàn)相關(guān)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn),98只Balb/c小鼠于屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,稱重(22.0±2.0) g,按照體重隨機(jī)分為7組,每組14只,實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水?dāng)z食。灌胃干預(yù)30 d后,各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對(duì)照組和各干預(yù)組給予0.04%(m/V)鹽酸洛哌丁胺溶液,正常對(duì)照組給予蒸餾水(劑量為20 mL/kg)30 min后,各干預(yù)組小鼠灌胃含相應(yīng)劑量受試物的阿拉伯膠墨汁懸液,正常對(duì)照組給予空白阿拉伯膠墨汁(劑量為20 mL/kg)。動(dòng)物單籠飼養(yǎng),正常飲水進(jìn)食,從灌胃阿拉伯樹膠開始計(jì)時(shí),記錄每只動(dòng)物首粒黑便時(shí)間、5 h內(nèi)黑便數(shù)量及重量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,滿足方差齊性要求后對(duì)干預(yù)組與對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD兩兩比較,以P<0.05作為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考保健食品檢驗(yàn)預(yù)評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[9]中排便與調(diào)節(jié)腸道菌群陽性結(jié)果判定方法執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 K56菌株對(duì)小鼠腸道菌群的影響

圖1可以看出,干預(yù)前與對(duì)照組比較,小鼠糞便雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均無顯著性差異(P>0.05),說明各組小鼠腸道菌群處于相同狀態(tài)。干預(yù)前后比較,對(duì)照組小鼠糞便中雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量對(duì)數(shù)值在實(shí)驗(yàn)后顯著增長(P<0.05);各組小鼠攝入副干酪乳桿菌K56菌株14 d后,小鼠糞便內(nèi)乳桿菌、雙歧桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)數(shù)值均顯著增加(P<0.05);腸桿菌和腸球菌未見顯著變化(P>0.05)。干預(yù)后與對(duì)照組相比,攝入副干酪乳桿菌K56菌株30 d后,中、高、極高劑量組小鼠糞便雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量對(duì)數(shù)值均顯著升高(P<0.05);極低、低、高劑量組小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌在干預(yù)30 d后數(shù)量對(duì)數(shù)值顯著降低(P<0.05),其他組別小鼠糞便菌群無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 攝入K56菌株前后動(dòng)物腸道菌群的變化

對(duì)照組前后比較,益生菌雙歧桿菌、乳桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌含量均增加,這可能跟動(dòng)物周齡有關(guān),小鼠隨著周齡增長腸道容量同時(shí)增長,腸道定植菌群種類數(shù)量及腸道環(huán)境也隨之產(chǎn)生變化,但變化總趨勢(shì)為益生菌含量增加、條件致病菌減少或無變化。本研究中參考保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范中判定標(biāo)準(zhǔn):雙歧桿菌和/或乳桿菌明顯增加,腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌減少或無明顯變化或增加幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌增加的幅度,判定樣品調(diào)節(jié)腸道菌群功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)陽性。干預(yù)后腸道菌群變化符合陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),推論副干酪乳桿菌K56具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。

各劑量組組間比較發(fā)現(xiàn)(圖1A、圖1B),兩種益生菌雙歧桿菌和乳桿菌在糞便中的含量隨著劑量增加而增加,當(dāng)劑量達(dá)到中劑量即人體劑量為108CFU/d,糞便中益生菌益生菌增長幅度最大且含量最高。隨著劑量繼續(xù)增高,糞便中的益生菌含量未見持續(xù)增加,而是趨于平衡,說明中劑量的K56(人體劑量為108CFU/d)可達(dá)到調(diào)節(jié)腸道菌群的最高效果。

2.2 副干酪乳桿菌K56對(duì)小鼠腸道運(yùn)動(dòng)功能的影響

由表1可見,模型組小鼠的墨汁推進(jìn)率顯著低于正常對(duì)照組的墨汁推進(jìn)率(P<0.05),提示本實(shí)驗(yàn)中腸道蠕動(dòng)抑制模型建立。與模型組比較,低、高、極高劑量組小鼠腸道運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中的墨汁推進(jìn)率顯著增高(P<0.05),極低劑量組和中劑量組與模型組比較未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但呈現(xiàn)了一定的增高趨勢(shì)。

表1 副干酪乳桿菌K56對(duì)小鼠墨汁推進(jìn)率的影響

既往研究表明副干酪乳桿菌可改變腸道中短鏈脂肪酸SCFAs含量,其中丁酸為腸道細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)提供能量,促進(jìn)腸道細(xì)胞的增殖,提高腸道動(dòng)力,加快腸道蠕動(dòng)速率[16],發(fā)揮潤腸通便作用。108CFU/g副干酪乳桿菌L9每日0.2 mL可以連續(xù)干預(yù)21 d,小鼠腸道中SCFAs乙酸、丙酸、丁酸合成增加[17]。107、108、109CFU/g副干酪乳桿菌連續(xù)干預(yù)15 d,小鼠糞便中乙酸、丁酸、丙酸和戊酸的含量均增加[16]。本研究中墨汁推進(jìn)率并未呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,可能原因是:組間動(dòng)物消化系統(tǒng)具有一定的差異;實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物依據(jù)體重給予鹽酸洛哌丁胺溶液,因給予體積不同,其抑制腸道蠕動(dòng)的效果也存在差別,但各組與模型組比較均呈現(xiàn)增高趨勢(shì),表明副干酪乳桿菌K56長期干預(yù)具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的功能。

2.3 副干酪乳桿菌K56對(duì)小鼠排便功能的影響

圖2可見,模型組小鼠首粒黑便時(shí)間與正常對(duì)照組比較顯著延長(P<0.05),黑便粒數(shù)和黑便重量較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05),說明小鼠腸蠕動(dòng)抑制模型建立。與模型組比較,副干酪乳桿菌K56菌株對(duì)小鼠首粒黑便時(shí)間無顯著影響(P<0.05),低、中劑量組小鼠首粒黑便時(shí)間具有縮短趨勢(shì),較模型組分別縮短了10.15%和11.22%(見圖2A)。中劑量組和高劑量組小鼠黑便粒數(shù)和黑便重量顯著增加(P<0.05),其中黑便粒數(shù)分別增加44.42%和56.22%(見圖2B),黑便重量分別增加44.76%和63.81%(見圖2C)。

圖2 副干酪乳桿菌K56對(duì)小鼠排便功能的影響

保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范中規(guī)定,黑便粒數(shù)或黑便重量一項(xiàng)結(jié)果陽性,同時(shí)小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和排便時(shí)間一項(xiàng)結(jié)果陽性,可判定該樣品通便功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。本研究中中、高劑量組排便粒數(shù)與排便重量結(jié)果陽性,高、極高劑量組小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性,可推論副干酪乳桿菌K56人體劑量達(dá)到高劑量即人體劑量為109CFU/d時(shí),可產(chǎn)生促進(jìn)腸道蠕動(dòng)改善便秘的功效。這與既往研究中4×108CFU/d熱滅活副干酪乳桿菌Lc19[17]可顯著增加便秘小鼠排便能力,107CFU/d副干酪乳桿菌N1115[18]可顯著增加小鼠排便量及糞便含水量的有效劑量相近。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,但實(shí)驗(yàn)在中劑量時(shí)開始出現(xiàn)陽性結(jié)果,說明隨著劑量增加,開始逐漸出現(xiàn)便秘改善的效果,且在高劑量組時(shí)可判定副干酪乳桿菌具有改善便秘的功效。當(dāng)達(dá)到極高劑量時(shí),改善便秘的效果并不顯著,這可能與造模程度及2.1中腸道菌群并未隨劑量增加而增加有關(guān)聯(lián)。

3 結(jié)論

本研究中副干酪乳桿菌K56的攝入促進(jìn)了小鼠腸道中雙歧桿菌和乳桿菌的增殖,同時(shí)具有促進(jìn)小鼠排便的作用,可推測攝入副干酪乳桿菌K56對(duì)于改善腸道微生態(tài),促進(jìn)腸道健康具有積極的作用。參考保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范中調(diào)節(jié)腸道菌群和通便功能評(píng)價(jià)方法中的陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn),可認(rèn)為副干酪乳桿菌K56具有調(diào)節(jié)腸道菌群功能和通便功能。以人體每日攝入量作為參照進(jìn)行研究,結(jié)果未呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,但0.0867、0.867、8.67 mg/kg(108、109和1010CFU/d人體劑量)均可以顯著增加腸道中益生菌的含量,因此推斷副干酪乳桿菌K56調(diào)節(jié)腸道菌群動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最適劑量為0.0867 mg/kg(108CFU/d人體劑量)。0.867 mg/kg(109CFU/d人體劑量)可以顯著(P<0.05)促進(jìn)腸道蠕動(dòng),但在本試驗(yàn)中以極高劑量(1010CFU/d人體劑量)干預(yù)小鼠,腸道菌群雖發(fā)生變化,通便實(shí)驗(yàn)未見顯著效果,需要做進(jìn)一步驗(yàn)證。副干酪乳桿菌K56屬于乳桿菌,后期將對(duì)其功效及安全性進(jìn)行系統(tǒng)研究,為其在食品中及更廣泛的應(yīng)用提供科學(xué)支持。