基于免疫磁珠的膠體金免疫層析法快速檢測水產品中地西泮殘留

桑麗雅,陳笑笑,王 揚,陳青舟,周 欽,李詩言,葉 茂,*

(1.杭州南開日新生物技術有限公司,浙江杭州 311215;2.浙江省水產質量檢測中心,浙江杭州 310023)

地西泮(Diazepam,DZP)又名安定,是一種苯二氮卓類中樞神經系統鎮靜劑,臨床上主要用于治療焦慮、鎮靜催眠、抗癲癇等[1-2]。近年來,隨著畜牧養殖業的迅速發展,在提高飼料轉化率和高額利潤的驅動下,地西泮被大量非法用作動物生長促進劑[3]。當人體長期攝入含地西泮殘留的動物源性食品后,會引起記憶受損、頭腦昏沉,甚至白細胞和運動神經受損等嚴重不良反應,給人類健康帶來嚴重的潛在威脅[4-5]。2002年,我國農業部發布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》(第193號公告)和《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(第235號公告)中明確規定,地西泮只能用于治療,禁止用于食品動物抗應激、提高飼料報酬和促生長,不得在動物性食品中檢出[6-7]。

目前,地西泮殘留檢測方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[8-9]、氣相色譜串聯質譜法(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)[10]、液相色譜串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[11-13]以及酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[14-15]等。這些方法雖然靈敏度高、準確性好,但樣本前處理復雜、耗時長、費用高,難以滿足現場大批量快速檢測要求。因此,如何快速、準確檢測動物源性食品中地西泮殘留,具有重要的意義。

膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatographic assay,CGICA)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型檢測方法,因其簡便快速、結果直觀,無需復雜操作和特殊設備等特點,成為了食品安全快速檢測的有效方法。柳愛春等[16]采用CGICA檢測水產品中的喹諾酮類藥物,靈敏度高于HPLC法,檢測結果與LC-MS/MS法較一致,單個樣品檢測耗時25 min。霍如林等[17]制備了豬肝中喹乙醇殘留的膠體金免疫層析試紙條,可在15 min內完成定性和定量檢測;Han等[18]利用CGICA建立的多條帶免疫層析法,能在10 min左右完成羊體液中磺胺類藥物的快速檢測。但CGICA在實際應用中仍存在靈敏度低、不能滿足低檢測限檢測要求等不足[19]。本研究建立了一種快速檢測水產品中地西泮殘留的免疫磁珠-膠體金免疫層析法,利用免疫磁珠實現地西泮的高倍數富集和快速分離[20-21],從而提高檢測方法的靈敏度,可用于實際水產品中地西泮殘留的現場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚、蝦、鱉等樣本 均來自杭州市某農貿市場,取可食用部分約100 g,用組織搗碎機充分絞碎混勻,裝入干凈容器,標明標識,-18 ℃避光保存;地西泮、氟西泮、替馬西泮、奧沙西泮、氟硝西泮標準品 中國醫藥(集團)上海化學試劑公司;鏈霉親和素磁珠 賽默飛世爾科技公司(挪威);地西泮單克隆抗體、包被抗原 課題組自制;牛血清白蛋白(BSA)、羊抗鼠二抗 美國Sigma公司;活潑酯化的長鏈生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin) 美國Pierce公司;C18固相萃取柱(3 mL,500 mg) 美國Supelco公司;其余試劑 均為國產分析純。

Agilent 6890N-5973I氣相色譜質譜聯用儀 美國Agilent公司;紫外-可見分光光度計、磁力架 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;BioJet XYZ3000型點膜機、CM4000型試紙條切割機 美國BioDot公司;硝酸纖維素膜(NC膜) 美國Millipore公司;MYP11-2恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀儀表制造有限公司;Avanti J-26XP高速冷凍離心機 美國Beckman公司;DHG-9023A型恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實業設備有限公司;膠體金讀數儀 杭州南開日新生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地西泮膠體金免疫層析試劑卡制備

1.2.1.1 膠體金制備及其標記抗體優化 將100 mL 0.01%氯金酸溶液置于儀器上加熱至沸騰后,加入1 mL 0.1%檸檬酸三鈉水溶液,保持煮沸15 min,冷卻至室溫后,用0.1 mol/L K2CO3和0.1 mol/L HCl調節pH至9,4 ℃保存備用,并用可見光-紫外分光光度計(400～800 nm)測定溶液的吸收峰波長和吸收值。

將地西泮單克隆抗體用0.01 mol/L的PB緩沖液(pH7.4)配制成0.5 mg/mL溶液,15000 r/min 4 ℃離心30 min,去除蛋白聚合物。取5支小試管中分別加入1 mL膠體金溶液和10、15、20、25、30 μg/mL的抗體用量進行預標記,10 min后每管分別加入10 μg BSA結合未標記完全的膠體金。標記結束后,每個濃度的金標抗體溶液均取2 μL滴加到空白膠體金墊上,分別滴加PBS(0.01 mol/L)和地西泮標準品(1 μg/L),篩選抗體最佳標記量。余下的膠體金溶液,以抗體最佳標記量進行標記,15000 r/min離心30 min,棄上清,沉淀用10 mL金標抗體保存液使其復溶,4 ℃保存備用。

1.2.1.2 NC膜抗原、羊抗鼠二抗包被量優化 T線抗原濃度分別設置0.3、0.6和1.2 mg/mL三個濃度;C線羊抗鼠二抗濃度分別設置0.75、1.50和3.00 mg/mL三個濃度,抗體以最佳標記量進行標記,分別滴加PBS(0.01 mol/L)和地西泮標準品(1 μg/L),使用膠體金讀數儀進行讀數。判定原則:T/C比值1.0(T線比C線淡或幾乎看不見)為陽性;T/C比值≥1.0(T線比C線深或一樣深)為陰性;若未出現任何色帶或C線未出現,則此試劑卡已失效、過期或操作不當,需另做一次測試。

1.2.1.3 金標抗體噴量優化 分別選擇2.0、3.0和4.0 μL/cm三個噴量,按照已經篩選出的最佳T線抗原濃度、C線羊抗鼠二抗濃度和抗體標量,制備膠體金試紙條,分別滴加PBS(0.01 mol/L)和地西泮標準品(1 μg/L),使用膠體金讀數儀進行讀數。

1.2.1.4 試劑卡的制備及組裝 將金標抗體噴在膠體金墊上,然后用點膜儀將地西泮人工抗原(T線)、羊抗鼠二抗(C線)噴于NC膜上,37 ℃烘干后,按圖1方法組裝成膠體金試紙條。將試紙條切成寬度為3.84 mm,加塑料卡后制成試劑卡。

圖1 免疫膠體金試紙條結構示意圖

1.2.2 免疫磁珠-膠體金免疫層析法構建及評價

1.2.2.1 免疫磁珠的制備 參照周松等[22]制備免疫磁珠的方法并略加改進。取一定量的地西泮單克隆抗體溶于PBS(0.01 mol/L,pH7.4)中調整濃度至2～3 mg/mL,按摩爾比1∶3加入Sulfo-NHS-LC-Biotin,25 ℃下孵育2 h,用0.01 mol/L PBS透析3 d,獲得生物素化抗體按體積比1∶1加入甘油-20 ℃保存。

取1 mg鏈霉親和素磁珠,用800 μL PBS(0.01 mol/L)洗滌2次并重懸,磁力架磁吸分離移除上清,加入50 μg生物素化抗體,放置搖床上,70 r/min室溫下偶聯1 h,期間保持磁珠懸浮狀態。磁分離去上清,用1 mL封閉緩沖液(0.01 mol/L PBS,0.01% BSA)重懸,4 ℃封閉過夜。磁分離去上清,用800 μL PBST(0.01 mol/L PBS,0.05% Tween-20,pH7.4)洗滌洗滌3次,最后用1 mL 0.01 mol/L PBS重懸,4 ℃下保存。

1.2.2.2 樣品前處理 免疫磁珠法:準確稱取(4±0.05) g均質樣本,加入10 mL含20%甲醇-PBS(0.01 mol/L,pH7.4)溶液后于渦旋振蕩器上振蕩5 min,5000 r/min離心3 min。取0.5 mL上清液加入300 μL免疫磁珠,室溫下渦旋富集5 min。磁吸回收磁珠,并用PBS(0.01 mol/L,pH7.4)洗滌3次,200 μL純甲醇洗脫5 min,收集洗脫液用PBS(0.01 mol/L,pH7.4)稀釋至1 mL,供膠體金免疫層析試劑卡檢測。

常規處理法:參考Bugey等[23]和Ming等[24]的方法并優化,具體步驟為:準確稱取(4±0.05) g均質樣本,加入1 mL 1 mol/L鹽酸和4 mL乙腈,渦旋振蕩5 min,之后加1 g氯化鈣,渦旋振蕩5 min,5000 r/min離心5 min,取2 mL上清液于75 ℃氮氣吹干,加1 mL PBS(0.01 mol/L,pH7.4)復溶,供膠體金免疫層析試劑卡檢測。

樣品凈化:當按免疫磁珠法進行前處理時,收集的洗脫液用水稀釋至1 mL,作為備用液;當按常規處理法進行樣品前處理時,經氮氣吹干的殘余物中加入1 mL水復溶,作為備用液。依次用3 mL甲醇,3 mL水活化C18固相萃取柱,取備用液過柱,3 mL甲醇-水(50∶50,v/v)洗滌,3 mL甲醇-水(70∶30,v/v)洗脫。洗脫液于50 ℃水浴下氮氣吹干,用200 μL乙腈溶解后供氣相色譜-質譜測定。

1.2.2.3 氣相色譜-質譜(GC-MS)條件 GC條件:色譜柱為DB-5MS柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm);載氣為氦氣;載氣流速0.9 mL/min;進樣口溫度290 ℃;程序升溫步驟為初始溫度150 ℃,保持1 min后以10 ℃/min程序升溫至290 ℃,保持4 min;進樣量1 μL,恒流模式,不分流。

MS條件:電子轟擊離子源(EI),電子轟擊能70 eV,離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;溶劑延遲9 min;選擇離子檢測模式(SIM),檢測離子(m/z)為283、256、241、221,定量離子(m/z)為256。

1.2.2.4 免疫磁珠-膠體金免疫層析法的評價 添加回收率測定:取經GC-MS法檢測確定的陰性水產樣品,分別添加1、5、10、15 μg/kg 4個不同濃度的西泮標準溶液,各濃度進行5個平行試驗,按上述免疫磁珠法進行樣品前處理,用GC-MS法測定樣品中地西泮濃度。計算回收率和相對標準偏差(RSD)。

回收率(%)=(實際檢測濃度/添標濃度)×100

相對標準偏差(RSD,%)=(實際檢測濃度的標準差/實際檢測濃度平均值)×100

檢出限評價:取經GC-MS檢測確定的陰性樣本分別添標至地西泮濃度為0、0.25、0.50、1.00 μg/kg,分別經免疫磁珠法和常規方法處理后,使用制備的地西泮膠體金檢測試劑卡進行檢測,每個濃度重復3次。

特異性評價:在經GC-MS檢測確定的陰性樣本中分別添加地西泮、氟西泮、替馬西泮、奧沙西泮以及氟硝西泮標準品0、0.5、1.0、2.0、10.0 μg/kg,每個濃度重復3次,評價方法的特異性。

穩定性評價:取3種不同批次試劑卡在37 ℃條件下放置20 d,分別于第1、5、10、15、20 d隨機抽取試劑卡檢測陰性樣本和0.5 μg/kg陽性添標樣本,評價方法的穩定性。

方法學分析:用本方法與國家標準《動物源性地西泮和安眠酮多殘留的測定 氣相色譜-質譜法》(GB 29697-2013)規定的GC-MS法分別檢測40份水產品樣本,包括添標檢測試驗和盲樣檢測試驗,進行方法學分析。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 膠體金的紫外掃描圖譜

制備的膠體金溶液,可經肉眼觀察到均一的酒紅色。將膠體金溶液在400～800 nm波長范圍內進行紫外掃描,結果見圖2所示。由圖2可知,膠體金溶液在波長524 nm左右有單一的最大吸收峰,峰寬較小,說明膠體金顆粒整體上比較均一。根據膠體金顆粒直徑與最大吸收峰之間的關系λ=0.4271φ+514.56[25]計算,膠體金的顆粒大小約為22 nm,符合膠體金層析法要求。

圖2 膠體金紫外可見分光掃描圖譜

2.2 地西泮膠體金免疫層析試紙條參數優化

2.2.1 標記抗體預試驗結果 T/C比值法在一定程度上可以消除時空、環境溫度以及樣本基質對試紙條顯色差異的影響,是一種較合理的膠體金定量檢測法[26]。本研究利用膠體金讀數儀分別讀取檢測卡T、C的顯色深度,以T/C值作為產品質控指標,要求控制陰性T/C值范圍為1.5～2.9、陽性T/C值范圍為0.5～0.9,并以陰性T/C值和陽性T/C值的差值判斷最佳。實驗以添加1 μg/L地西泮標準品的PBS溶液為陽性組,以等體積PBS溶液的空白對照為陰性組進行膠體金標記抗體預試驗,結果見表1。由表1可知,抗體標記量為20～30 μg/mL時,陰性T/C值符合質控要求;抗體標記量為15～30 μg/mL時,陽性T/C值符合質控要求。其中,當抗體標記量為25 μg/mL時,陰陽性梯度較好,即最佳抗體標記量為25 μg/mL。

表1 膠體金標記抗體預試驗結果

2.2.2 NC膜抗原、羊抗鼠二抗包被量優化試驗結果 NC膜抗原、羊抗鼠二抗包被量優化試驗結果見表2。由表2可知,滿足質控要求的T線的抗原包被量和C線的羊抗鼠二抗包被量為0.3和1.50 mg/mL、0.6和1.5 mg/mL、1.2和3.00 mg/mL。其中,0.6和1.50 mg/mL組陰性T/C值和陽性T/C值的差值最大,陰陽性梯度較好,故T線的抗原包被量最適濃度為0.6 mg/mL,C線的羊抗鼠二抗包被量最適濃度為1.50 mg/mL。

表2 NC膜抗原、羊抗鼠二抗包被量優化結果

2.2.3 金標噴量優化試驗結果 金標噴量優化試驗結果見表3。由表3可知,最優金標噴量為3.0 μL/cm,T線、C線顯色和陰陽性梯度都較好。

表3 金標噴量優化結果

2.3 免疫磁珠-膠體金免疫層析法性能評價

2.3.1 添加回收率的測定 對地西泮進行1、5、10、15 μg/kg 4個水平的空白添加回收試驗,各濃度設5個平行試驗,計算回收率和相對標準偏差。由表4可知,地西泮的平均回收率為78.34%～90.40%,RSD為5.03%～8.96%,說明本方法回收率較高,穩定性、重復性好,可滿足地西泮殘留檢測的要求。

表4 地西泮的添加回收率和相對標準偏差(n=5)

2.3.2 檢出限試驗結果 不同濃度地西泮添加到陰性樣本中,分別經免疫磁珠法和常規方法處理后,使用地西泮膠體金檢測試劑卡檢測,5 min后用膠體金讀數儀進行讀數,結果如表5所示。經常規方法處理,0～0.50 μg/kg地西泮添標濃度檢測結果為陰性,1.00 μg/kg時檢測結果為陽性。而經免疫磁珠法處理,地西泮添標濃度在0.25 μg/kg以下檢測結果為陰性,0.50 μg/kg以上檢測結果為陽性。由此可知,地西泮膠體金檢測試劑卡以免疫磁珠法處理時,檢出限為0.50 μg/kg,明顯優于常規前處理方法。

表5 不同前處理方法的檢測結果

2.3.3 特異性試驗結果 通過檢測地西泮和四種地西泮結構類似物,來判定地西泮膠體金檢測試劑卡是否具有特異性。結果顯示,試劑卡檢測不同濃度的氟西泮、替馬西泮、奧沙西泮和氟硝西泮,結果均為陰性(見表6)。說明該試劑卡特異性良好,能保證檢測時避免其他藥物的干擾。

表6 特異性試驗的T/C平均值

2.3.4 穩定性試驗結果 試劑卡在37 ℃條件下放置20 d,于不同時期隨機抽取進行穩定性試驗。研究發現,試劑卡檢測讀數結果未發生明顯變化(見表7),說明在保存期內穩定性很好。

表7 穩定性試驗結果

2.3.5 與氣相色譜-質譜法(GC-MS)比較試驗結果 由國家標準《動物源性地西泮和安眠酮多殘留的測定 氣相色譜-質譜法》(GB 29697-2013)可知,GC-MS法的檢出限為0.5 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg。用免疫磁珠-膠體金免疫層析法和GC-MS法對40份水產樣本(其中魚肉樣本20份、蝦肉樣本10份、鱉肉樣本10份)進行檢測,其中10份陰性樣本、10份添加0.5 μg/kg的陽性添標樣本和20份隨機盲樣,結果見表8和表9。結果表明,在添標檢測試驗和盲樣檢測試驗中,免疫磁珠-膠體金免疫層析法與GC-MS法的檢測結果一致,適用于實際樣品中地西泮的檢測。

表8 不同檢測方法的添標檢測試驗結果對比

表9 不同檢測方法的盲樣檢測試驗結果對比

3 結論

免疫磁珠可通過磁場作用特異性分離、富集目的物,具有簡便快速、靈敏度高、特異性強等特點,已廣泛應用于食品微生物檢測、細菌毒素檢測、生化及分子遺傳學等領域[20]。

本研究建立了一種快速檢測水產品中地西泮殘留的免疫磁珠-膠體金免疫層析法。該方法利用免疫磁珠選擇性吸附、分離水產品中地西泮殘留,操作簡便、靈敏度高,平均回收率為78.34%～90.40%,RSD為5.03%～8.96%,單個樣本可在25 min內完成檢測,地西泮檢出限為0.5 μg/kg,優于常規前處理法。同時優化了地西泮膠體金檢測試劑卡,最佳工藝為金標抗體標記量25 μg/mL、T線抗原包被量0.6 mg/mL、C線羊抗鼠二抗包被量1.50 mg/mL、金標噴量3.0 μL/cm。經驗證,該方法特異性強、穩定性好,檢測結果與GC-MS法結果一致,可用于水產品中地西泮殘留的現場快速檢測,為食品安全提供保障。