畜禽肉中金黃色葡萄球菌活菌可視化LAMP檢測方法的研究

陳 瓊,董華夏,戴小芳,劉 萍,晏 濤,酈 娟

(武漢食品化妝品檢驗所,湖北武漢 430012)

我國是世界上第一大的畜禽肉消費國[1],畜禽肉中的致病菌污染嚴重威脅著我國食品安全[2-3],其中,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)已成為生鮮畜禽肉中食源性致病菌的重大隱患[4-5]。

肉類食物因含有豐富的營養(yǎng)成分,可以滿足金黃色葡萄球菌的生長需求,使其產(chǎn)生腸毒素,這也是金黃色葡萄球菌引起食物中毒的主要原因[6]。金黃色葡萄球菌的檢驗一般按國標GB 4789.10-2016[7]進行傳統(tǒng)微生物檢驗,但是傳統(tǒng)微生物檢驗由于檢驗時間長,操作繁瑣,在實際操作中存在一定的限制[8]。現(xiàn)代分子生物學聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術由其操作簡單、快速,被廣泛的應用于食品安全檢測[9-10]。由于Bst DNA 聚合酶的使用使環(huán)介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)實現(xiàn)了在恒溫條件(60～65 ℃)下的快速擴增,并在1 h內(nèi)完成檢驗且無需復雜的儀器設備[11-12]。當前,基于LAMP法的金黃色葡萄球菌的快速檢測方法研究已成為熱門[13-14]。但是,由于PCR技術無法區(qū)分死菌和活菌,從而使反應結果容易出現(xiàn)假陽性[15],經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn),疊氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)在一定光照條件下可以與死菌DNA結合且不影響活菌DNA的擴增[16-17],因此在樣品處理階段添加一步PMA處理可有效抑制死菌的擴增,提高結果準確率[18-19]。同時在LAMP反應中添加熒光指示劑羥基萘酚藍(hydroxynaphthol blue,HNB),可使反應結果直接通過顏色來判斷[20-22]。

本研究建立的PMA-HNB-LAMP聯(lián)用技術可成功應用于畜禽肉中金黃色葡萄球菌活菌的快速檢測,實現(xiàn)了檢驗技術的高效快速準確,具有一定的推廣價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火腿腸(3份)、市售冷凍畜禽肉產(chǎn)品(共50份,豬肉10份、牛肉8份、羊肉7份、雞肉10份、鴨肉8份、鵝肉7份);實驗所用標準菌株及其他菌株,見表1 均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心或美國典型菌種保藏中心等;樣品分離菌株,見表2 為本實驗室日常檢測分離獲得;7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、血瓊脂平板、腦心浸出液肉湯(BHI) 北京陸橋技術股份有限公司;革蘭氏陽性細菌鑒定卡、革蘭氏陰性細菌鑒定卡 生物梅里埃美國股份有限公司;TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、DEAOU細菌基因組DNA快速提取試劑盒;金黃色葡萄球菌快速檢測試劑盒 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

表1 實驗所用標準菌株

表2 樣品分離菌株

X-30冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司;PL601-L電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH.S21-8-S數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;CFX96 TOUCH熒光定量PCR儀 美國伯樂公司;VITEK2 compact system全自動生化鑒定系統(tǒng) 美國Biomerieux公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP檢測方法的建立

1.2.1.1 DNA提取 標準菌株及分離菌株DNA提取:使用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)按說明書方法提取細菌DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測樣品增菌液DNA提取:檢測樣品按照GB 4789.10-2016[7]進行增菌培養(yǎng),使用DEAOU細菌基因組DNA快速提取試劑盒按說明書方法提取細菌DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 LAMP擴增體系的建立 參照SN/T 2754.1-2011《出口食品中致病菌環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)檢測方法 第1部分:金黃色葡萄球菌》設計引物和反應體系[23],反應體系見表3。反應條件設置為:63 ℃反應45 min。

表3 金黃色葡萄球菌LAMP擴增體系

1.2.1.3 HNB濃度的優(yōu)化實驗 制備濃度為106CFU/mL金黃色葡萄球菌活菌菌懸液,提取DNA。在建立的反應體系中加入終濃度為240、210、180、150、120、90、60、30 μmol/L的羥基萘酚藍,通過肉眼觀察反應結果。

1.2.2 HNB-LAMP法的特異性和靈敏度分析

1.2.2.1 靈敏度分析 標準菌株靈敏度分析:將金黃色葡萄球菌菌株接種到BHI增菌液中,(36±1) ℃培養(yǎng)12 h,用生理鹽水進行梯度稀釋,得到濃度為10～106CFU/mL的活菌菌懸液,每個稀釋度分別吸取1 mL以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別接種到三塊Baird-Parker平板進行計數(shù)[7]。同時,按照1.2.1.1提取DNA,并按前文所建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP反應體系進行檢測,進行靈敏度分析。

基質(zhì)靈敏度分析:取火腿腸25 g(按照GB 4789.10-2016[7]檢測為未污染目標菌樣品)加入到225 mL無菌生理鹽水中,均質(zhì)。分別取1 mL梯度稀釋純菌液加入到9 mL樣品勻漿里,混勻,同時進行計數(shù)以確定實際濃度。得到濃度為10～108CFU/mL的樣品勻液,抽提DNA作為模板,按照前文建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP反應體系,進行靈敏度分析。

1.2.2.2 特異性分析 將表1和表2的菌株進行培養(yǎng),按1.2.1提取各菌株的DNA,按照前文建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP反應體系,進行特異性分析。

1.2.3 HNB-LAMP法與其他檢測方法的比較 選取以鈣黃綠素-LAMP為檢驗原理的某金黃色葡萄球菌檢測試劑盒,比較其與本研究確定的HNB-LAMP法的標準菌株靈敏度和基質(zhì)靈敏度。

1.2.4 HNB-LAMP法檢測實際樣品 隨機選取15份冷凍畜肉和15份冷凍禽肉,在45 ℃以下不超過15 min解凍[7],分別稱取25 g加入盛有225 mL 7.5% 氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)袋中,均質(zhì)1～2 min,于(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)后的增菌液一分為二,一組參考國標法GB 4789.10-2016[7]進行定性檢測,一組經(jīng)HNB-LAMP法檢測,比較兩組最終的檢測結果。

1.2.5 PMA處理的優(yōu)化

1.2.5.1 不抑制活菌擴增的最高PMA濃度 吸取平板計數(shù)定量為104～107CFU/mL的菌懸液0.5 mL,加入不同量的PMA工作液,充分混勻,室溫避光孵育5 min,鹵素燈下曝光15 min[24],按1.2.1.1提取DNA進行qPCR反應。

1.2.5.2 完全抑制死菌擴增的最低PMA濃度 選擇平板計數(shù)定量為105～106CFU/mL的菌懸液,100 ℃煮沸10 min[17],吸取1 mL菌液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別接種三塊Baird-Parker平板,(36±1) ℃培養(yǎng)24～48 h,以確認金黃色葡萄球菌被完全滅活。吸取0.5 mL死菌菌懸液,加入不同量的PMA工作液,充分混勻,室溫避光孵育5 min,鹵素燈下曝光15 min,按1.2.1.1提取DNA進行qPCR反應。

1.2.6 PMA-HNB-LAMP檢測人工污染金黃色葡萄球菌的陽性樣品 人工污染2個火腿腸樣品(按照GB 4789.10-2016[7]檢測為未污染目標菌樣品),污染濃度約為105CFU/mL金黃色葡萄球菌活菌和死菌。利用傳統(tǒng)微生物方法、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法進行檢測。HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法直接取樣品勻液進行后續(xù)檢測,傳統(tǒng)微生物方法將樣品勻液作為7.5% NaCl肉湯增菌液進行后續(xù)檢驗。

1.2.7 PMA-HNB-LAMP檢測實際樣品 隨機選取10份冷凍畜肉和10份冷凍禽肉,在45 ℃以下不超過15 min解凍[7],分別稱取25 g加入盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)袋中,均質(zhì)1～2 min,于(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)后的增菌液一分為二,一組參考國標法GB 4789.10-2016[7]進行定性檢測,一組經(jīng)HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法檢測,比較三種方法的檢測結果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本文PCR反應的原始數(shù)據(jù)均由Bio-Rad CFX Manager處理后導出,然后采用EXCEL 2010版進行線性擬合和繪圖,并采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP法的建立

2.1.1 HNB濃度的選擇 實驗表明,向LAMP實驗體系中添加HNB,可以使反應結果通過簡單的顏色變化直觀的反映出來,即陽性為天藍色,陰性為紫羅蘭色[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn),當添加的HNB濃度在150～240 μmol/L范圍內(nèi)時,陰性和陽性結果差異明顯,結果見圖1。為保證建立的HNB-LAMP法具有高檢出率,本實驗選取210 μmol/L濃度的HNB添加到LAMP反應體系中。

圖1 LAMP反應體系中添加不同濃度的HNB的顯色結果

2.1.2 HNB-LAMP法的靈敏度分析

2.1.2.1 標準菌株的靈敏度分析 金黃色葡萄球菌HNB-LAMP法的靈敏度分析實驗結果見表4,由表4可知,本研究建立的HNB-LAMP法的菌株靈敏度為104CFU/mL。

表4 HNB-LAMP法的標準菌株靈敏度分析結果

2.1.2.2 人工污染樣品基質(zhì)的靈敏度分析 用HNB-LAMP法檢測人工污染金黃色葡萄球菌活菌的樣品時發(fā)現(xiàn)當樣品-菌混合液中金黃色葡萄球菌活菌的濃度為105～108CFU/mL時,反應結果呈陽性,見表5。由表5可知,建立的HNB-LAMP法的樣品基質(zhì)靈敏度為105CFU/mL。

表5 HNB-LAMP法的樣品基質(zhì)靈敏度分析結果

2.1.2.3 HNB-LAMP法與其他檢測方法的靈敏度比較 挑選以鈣黃綠素-LAMP法為檢驗原理的某金黃色葡萄球菌快速檢測試劑盒,以濃度為10～106CFU/mL的金黃色葡萄球菌活菌DNA作為模板,按試劑盒說明書進行擴增反應,反應結果見表6。由表6可知,市售的某金黃色葡萄球菌檢測試劑盒的標準菌株靈敏度為104CFU/mL。本研究建立的HNB-LAMP法與市售的成品試劑盒的標準菌株靈敏度相同。

表6 市售的某金黃色葡萄球菌檢測試劑盒的標準菌株靈敏度分析結果

在用上述市售的金黃色葡萄球菌檢測試劑盒檢測人工污染金黃色葡萄球菌的樣品基質(zhì)實驗中,可以發(fā)現(xiàn)當金黃色葡萄球菌的濃度為106～108CFU/mL時,反應結果呈陽性,結果見表7。由表7可知,市售的某金黃色葡萄球菌檢測試劑盒的樣品基質(zhì)靈敏度為106CFU/mL。本研究建立的HNB-LAMP法的樣品基質(zhì)靈敏度略優(yōu)于市售的成品試劑盒的樣品基質(zhì)靈敏度。

表7 市售的某金黃色葡萄球菌檢測試劑盒的樣品基質(zhì)靈敏度分析結果

2.1.3 HNB-LAMP法的特異性分析 利用建立的金黃色葡萄球菌可視化HNB-LAMP法,按照1.2.2.2進行特異性分析,結果見表8。由表8可知,建立的HNB-LAMP法特異性好,金黃色葡萄球菌均被檢出,其他非金黃色葡萄球菌均未被檢出。

表8 HNB-LAMP法的特異性分析結果

2.1.4 HNB-LAMP法檢測實際樣品 利用傳統(tǒng)微生物檢法GB 4789.10-2016[7]檢測30份實際冷凍畜禽肉樣品時,發(fā)現(xiàn)3個樣品結果呈陽性;用建立的HNB-LAMP法檢測實際樣品時,有12個樣品結果呈陽性,其中包括傳統(tǒng)微生物法檢測出的3個陽性樣品。這表明,HNB-LAMP法雖然大大縮短了檢測時間,但同時由于其無法區(qū)分死菌和活菌而出現(xiàn)了假陽性結果。

2.2.1 不抑制活菌擴增的最高PMA濃度 用不同濃度的PMA處理104～107CFU/mL的金黃色葡萄球菌活菌時,發(fā)現(xiàn)各濃度的金黃色葡萄球菌活菌經(jīng)10 μg/mL的PMA處理后Ct值均無明顯變化,結果見圖2。由圖2可知,不抑制活菌擴增的最高PMA濃度可以確定為10 μg/mL。

圖2 不同濃度PMA處理對活菌擴增的影響結果

2.2.2 完全抑制死菌擴增的最低PMA濃度 當以不同濃度PMA處理濃度為104～107CFU/mL的金黃色葡萄球菌死菌時,PMA濃度為10 μg/mL可以完全抑制104、105CFU/mL的死菌DNA擴增,結果見圖3。由圖2、圖3最終確定金黃葡萄球菌的PMA處理濃度為10 μg/mL,在該濃度條件下,既可以完全抑制不高于105CFU/mL的死菌DNA擴增,又不影響不低于104CFU/mL的活菌DNA擴增。

圖3 10 μg/mL PMA處理不同濃度金黃色葡萄球菌死菌的DNA擴增結果

2.3 PMA-HNB-LAMP法檢測人工污染金黃色葡萄球菌樣品的檢測結果

采用PMA-HNB-LAMP法、HNB-LAMP法、傳統(tǒng)微生物法(GB 4789.10-2016)三種方法檢測人工污染金黃色葡萄球菌的樣品的檢測結果如表9所示。由表9可知,本研究建立的PMA-HNB-LAMP法與傳統(tǒng)微生物法的檢測結果一致,而HNB-LAMP法在檢測時由于無法區(qū)分死菌和活菌而出現(xiàn)了假陽性結果。

表9 采用三種方法檢測人工污染金黃色葡萄球菌樣品的檢測結果

2.4 PMA-HNB-LAMP法檢測實際樣品的檢測結果

10份冷凍畜肉和10份冷凍禽肉同時經(jīng)國標法GB 4789.10-2016、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法檢測,檢測結果如表10所示。由表10可知,20份樣品經(jīng)三種方法檢測確認為陽性的樣品個數(shù)依次為6個、5個、5個;檢出率分別為30%、25%、25%。

表10 采用三種方法對實際樣品的檢測結果

3 結論與討論

為實現(xiàn)快速檢測畜禽肉中的金黃色葡萄球菌活菌的污染情況,本研究建立了一套儀器設備要求簡單、耗費低、操作簡便、結果可視化的金黃色葡萄球菌PMA-HNB-LAMP法,該方法既解決了傳統(tǒng)微生物法操作繁瑣、檢驗周期長、生化鑒定復雜的問題,又在檢驗過程中有效的避免了可能由死菌DNA擴增造成的假陽性結果。建立的金黃色葡萄球菌PMA-HNB-LAMP檢測方法特異性強,其純菌液靈敏度為104CFU/mL,樣品基質(zhì)靈敏度為105CFU/mL,根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)和國外一些學者的研究[25-27],均將金黃色葡萄球菌的最小產(chǎn)毒濃度定為105CFU/g,即在該濃度下可產(chǎn)生1.0 μg腸毒素而引起食物中毒,本研究建立的金黃色葡萄球菌快速檢測方法在現(xiàn)有的檢出限下,可用于快速檢測出含有高于最小產(chǎn)毒濃度金黃色葡萄球菌活菌的高風險致病樣品。同時,靈敏度不高也是該法面臨的實際問題,需要在今后研究中對方法進行進一步的優(yōu)化改進。將建立的金黃色葡萄球菌可視化PMA-HNB-LAMP法應用于檢測實際樣品時,發(fā)現(xiàn)其陽性樣品檢出率略低于傳統(tǒng)微生物法GB 4789.10-2016[7]的檢出率,但是無假陰性結果的出現(xiàn),推其原因可能是購買的冷凍生畜禽肉中存在某些抑制LAMP擴增的因素,具體原因及解決方法有待進一步研究。該法除了用于畜禽肉的檢測外,還可以應用到其他種類的食品檢測中,具有很廣的應用前景。