量子點(diǎn)熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)番茄醬中羅丹明B的研究

胡高爽,高 山,*,韓 雪,王 君,李 娜

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050000;2.滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河北滄州 061000;3.河北英茂生物科技有限公司,河北石家莊 050000)

羅丹明B(Rhodamine B)又名玫瑰紅B,分子式為C28H31ClN2O3,是一種人工合成的堿性熒光染料。根據(jù)國(guó)際癌癥研究署(IARC)化學(xué)品致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估表明,羅丹明B具有強(qiáng)烈的“三致”(致癌、致畸、致突變)風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。國(guó)家衛(wèi)生部門在食品整治辦(2008)3號(hào)文件“關(guān)于印發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》的通知”中,將羅丹明B納入首批可能違法添加的非食用物質(zhì),嚴(yán)禁在食品中添加[4]。

目前針對(duì)羅丹明B檢測(cè)的方法有很多種,主要包括光譜法[5]、高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[6-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)[10-13]等。然而這些檢測(cè)方法需要昂貴的儀器設(shè)備、檢測(cè)過程繁瑣耗時(shí)較長(zhǎng),無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。基于抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫學(xué)方法,具有快速靈敏、特異性強(qiáng),實(shí)際操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[14-16],其中免疫親和凝膠檢測(cè)柱是基于免疫親和檢測(cè)法發(fā)展起來的一種可視化快速檢測(cè)方法。但是,傳統(tǒng)的免疫分析技術(shù)大多采用酶蛋白作為標(biāo)記物,容易受到基質(zhì)的影響,繁瑣的樣品前處理過程阻礙了實(shí)驗(yàn)方法靈敏度的提升。

近年來,熒光技術(shù)得到了國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注,并逐漸應(yīng)用于免疫分析技術(shù)中[17-19]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是一種兩個(gè)相互靠近的供體與受體通過偶極子-偶極子相互作用而產(chǎn)生的非輻射性的過程,其中熒光猝滅是熒光能量共振轉(zhuǎn)移導(dǎo)致現(xiàn)象之一[20-22]。本研究旨在建立一種基于量子點(diǎn)的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱方法,并將其應(yīng)用于番茄醬中羅丹明B的快速分析檢測(cè)。該方法基于熒光供體(羧基化量子點(diǎn),最大發(fā)射波長(zhǎng)為532 nm)與熒光受體(羅丹明B,最大吸收波長(zhǎng)為554 nm,最大的熒光波長(zhǎng)為610 nm)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅的現(xiàn)象,結(jié)合免疫親和凝膠檢測(cè)柱的特異性識(shí)別作用,以實(shí)現(xiàn)番茄醬中羅丹明B的快速分析檢測(cè),可用于番茄醬中羅丹明B的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溴化氫活化瓊脂糖凝膠-4B、甘氨酸(Glycine) 分析純,美國(guó)Sigma公司;鹽酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙酸鈉均 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;羅丹明B單克隆抗體 山東綠都生物科技有限公司;羧基化ZnCdSe/ZnS量子點(diǎn)(最大發(fā)射波長(zhǎng)532 nm) 武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限公司;亨氏番茄醬樣品 當(dāng)?shù)爻小?/p>

Shimadzu UV-2300紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司;F-4500熒光光譜儀 日本Hitachi公司;四用暗箱紫外分析儀 上海勤科分析儀器有限公司;高效液相色譜儀、waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國(guó)waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅丹明B分析物抗體膠的制備 將羅丹明B抗體與溴化氫活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備羅丹明B分析物抗體膠,具體偶聯(lián)的過程如下[23-25]:1.0 g的溴化氫活化瓊脂糖凝膠與80 mL 1 mmol/L HCl溶液混合攪拌均勻并放置溶脹10 min;將溶脹好的凝膠轉(zhuǎn)移到具砂板層析柱中,穩(wěn)定后再用200 mL HCl溶液對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行淋洗。取10 mL偶聯(lián)緩沖液(2.92 g NaCl,0.84 g NaHCO3,加入100 mL雙蒸水,用NaOH調(diào)pH至8.3),分三次倒入層析柱中,將瓊脂糖凝膠體系調(diào)節(jié)至中性。取適量羅丹明B單克隆抗體(4 mg/mL)用緩沖液稀釋后加入到具砂板層析柱中,室溫條件下振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后,再進(jìn)行三次沖洗。隨后加入10 mL的甘氨酸封閉液(0.3 g甘氨酸加入到10 mL的偶聯(lián)緩沖液中)進(jìn)行封閉,室溫下連續(xù)振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后,用已配好的醋酸鈉緩沖液(2.92 g NaCl,0.58 mL CH3COOH,加入100 mL雙蒸水溶解,再用無水乙酸鈉調(diào)pH至4.0)和偶聯(lián)緩沖液各10 mL依次倒入具砂板層析柱中對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行沖洗,此步驟重復(fù)三次,待緩沖液全部自然流出后,抽空瓊脂糖凝膠中的清洗液,用磷酸鹽緩沖液將制備好的封閉膠懸起,放置于冰箱中4 ℃保存,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作的正常使用。

1.2.2 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱的組裝和檢測(cè) 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱只由單層檢測(cè)層組成的,取一個(gè)聚乙烯墊片放入1 mL的塑料柱,然后在塑料柱中加入150 μL混勻混合的分析物抗體膠,注射器置于塑料柱上加壓將其中所帶的磷酸鹽緩沖液壓出,塑料管中剩余的濃縮分析物抗體膠即為熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱的檢測(cè)層。在檢測(cè)柱中放入第二片聚乙烯墊片,如圖1所示,將其壓至分析物抗體膠的上面,使分析物抗體膠上下分別被兩墊片固定住。在檢測(cè)柱中加入含有羅丹明B的樣品溶液,用注射器加壓,將磷酸鹽緩沖液繼續(xù)壓出,然后加入50 μL制備好的一定稀釋倍數(shù)的ZnCdSe/ZnS量子點(diǎn)溶液,通過注射器施加壓力使加入的量子點(diǎn)溶液完全侵入檢測(cè)柱分析物抗體凝膠中,即可完成羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱的組裝和檢測(cè),通過觀察檢測(cè)層熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)羅丹明B的快速分析檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 樣品前處理的方法參考先前的文獻(xiàn)并做了進(jìn)一步的改進(jìn)[26-27],取1 g番茄醬樣品,分別添加一系列濃度的羅丹明B(5.0、10.0和20.0 μg/kg),加入1 mL水,混合均勻,加入4 mL乙腈,劇烈振蕩30 s,使羅丹明B充分溶解;再加入5 mL正乙烷,劇烈振蕩5 min,除去體系中存在的脂肪等干擾;離心至上下分層明顯后,取出1 mL乙腈相并用氮?dú)獯蹈?用1 mL PBS復(fù)溶,然后用所構(gòu)建的羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 HPLC分析 為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性,參考SN/T 2430-2010 《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》中的高效液相色譜檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入25 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液(1∶1,體積比),于旋渦混勻器上混合提取2 min,再超聲提取15 min后,于4000 r/min離心5 min,上清液過0.22 μm微孔濾膜后作待凈化液。HPLC分析條件:色譜柱:Waters C184.6 mm×250 mm,5 μm;激發(fā)波長(zhǎng):550 nm 發(fā)射波長(zhǎng)580 nm;流動(dòng)相:A(甲醇)∶B(水)4∶1 (v/v);流速1.0 mL/min,進(jìn)樣體積20 μL;柱溫:35 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅丹明B量子點(diǎn)熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱原理

本研究基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理,建立了一種針對(duì)番茄醬中非法著色劑羅丹明B進(jìn)行快速檢測(cè)的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱方法,其原理如圖1所示。首先將特異性識(shí)別羅丹明B的單克隆抗體與溴化氫活化瓊脂糖凝膠-4B偶聯(lián)制備檢測(cè)柱的檢測(cè)層。當(dāng)加入含有羅丹明B樣品時(shí),羅丹明B就被抗體特異性的吸附到檢測(cè)層。再向體系中加入適量的羧基化ZnCdSe/ZnS量子點(diǎn),這時(shí)由于量子點(diǎn)表面富含羧基,羧基為陰離子,帶有負(fù)電荷,羅丹明B是帶有正電荷的雜環(huán)堿性染料,兩者之間能夠通過靜電引力的相互作用緊密結(jié)合在一起,滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移的對(duì)距離的要求。同時(shí)ZnCdSe/ZnS量子點(diǎn)的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)(532 nm)與羅丹明B最大吸收波長(zhǎng)(554 nm)發(fā)生重疊,能夠滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移的光譜重疊的要求。這時(shí)量子點(diǎn)與羅丹明B發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,出現(xiàn)量子點(diǎn)(綠色熒光)熒光猝滅而羅丹明B熒光(紅色熒光)增強(qiáng)的現(xiàn)象。樣品中羅丹明B含量越多,與抗體特異性結(jié)合越多,在檢測(cè)層中與量子點(diǎn)溶液發(fā)生熒光猝滅越明顯,檢測(cè)層觀察到的量子點(diǎn)(綠色熒光)熒光猝滅而羅丹明B熒光(紅色熒光)增強(qiáng)現(xiàn)象越明顯。本研究根據(jù)檢測(cè)層中熒光亮度變化為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo),當(dāng)檢測(cè)層中的綠色熒光發(fā)生明顯變化,此時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度確立為羅丹明B的檢測(cè)限。

圖1 羅丹明B量子點(diǎn)熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱原理圖

2.2 量子點(diǎn)熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱條件優(yōu)化

2.2.1 分析物抗體膠中抗體量的確定 在制備分析物抗體膠的過程中,抗體添加量過少或過多,抗原抗體的特異性結(jié)合會(huì)受到影響,結(jié)合到分析膠上的抗體越多,檢測(cè)層富集分析物的能力越強(qiáng),因此在相同熒光強(qiáng)度下方法的靈敏度也就越高。然而,抗體添加量過多,不僅會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本的提高,而且過多的抗體會(huì)導(dǎo)致凝膠上抗體蛋白分布不均或自聚集影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。因此,分析物抗體膠制備過程中抗體添加量是非常重要的因素。分別取不同量的羅丹明B單克隆抗體(0、1.0、2.0和3.0 mg)與固定量1.0 g的溴化氫活化的瓊脂糖凝膠發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)制備檢測(cè)層,固定羅丹明B添加濃度(3.0 μg/L)、上樣體積(1.0 mL)以及量子點(diǎn)濃度(稀釋3000倍)等其他條件,按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品操作,在紫外分析儀365 nm的UV光照下,選擇導(dǎo)致熒光強(qiáng)度明顯變化的最小抗體添加量作為抗體膠中最佳抗體量。結(jié)果如圖2所示,2.0 mg羅丹明B單克隆抗體與1.0 g的瓊脂糖凝膠結(jié)合,檢測(cè)層中的綠色熒光完全消失,熒光淬滅現(xiàn)象明顯。因此,選擇2.0 mg羅丹明B單克隆抗體(每1.0 g溴化氫活化的瓊脂糖凝膠)為分析物抗體膠中抗體量的最優(yōu)值。

圖2 分析物抗體膠中抗體量的優(yōu)化

2.2.2 量子點(diǎn)稀釋倍數(shù)的確定 量子點(diǎn)稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)體系的靈敏度也有重要影響。若稀釋倍數(shù)過大,量子點(diǎn)濃度小則熒光亮度較低,不易觀察;若溶液稀釋倍數(shù)太小,熒光亮度過大,則熒光猝滅效應(yīng)不易發(fā)生。本研究中,ZnCdSe/ZnS量子點(diǎn)原溶液濃度為8 μmoL/L,實(shí)驗(yàn)中用磷酸鹽緩沖液將量子點(diǎn)溶液分別稀釋1000、2000、3000和4000倍,用優(yōu)化好的抗體膠、固定體積(1.0 mL)和固定濃度(3.0 μg/L)的羅丹明B溶液,按上述實(shí)驗(yàn)方法操作,選擇能夠?qū)е聶z測(cè)層中熒光猝滅的最小稀釋倍數(shù)作為最佳稀釋倍數(shù)。在紫外分析儀365 nm的UV光照下,各個(gè)檢測(cè)柱的結(jié)果如圖3所示,當(dāng)量子點(diǎn)溶液稀釋3000倍時(shí)檢測(cè)柱中熒光亮度發(fā)生猝滅效果最好。

圖3 量子點(diǎn)稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

2.2.3 孵育時(shí)間的確定 實(shí)驗(yàn)中分析物與抗體孵育時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響抗原抗體結(jié)合與非特異性吸附程度,適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間可以確保分析物和抗體之間的特異性識(shí)別和結(jié)合,減少非特異性吸附作用,從而提高檢測(cè)的靈敏度。因此,需要對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。按上述實(shí)驗(yàn)方法,以1.0 mL羅丹明B(濃度為3.0 μg/L)上樣量為基準(zhǔn),在檢測(cè)柱中加入羅丹明B溶液并加壓使其流至檢測(cè)層時(shí),開始計(jì)算孵育時(shí)間,時(shí)間分別控制為30、40、50、60、70 s,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,在紫外分析儀365 nm的UV光照下觀察。結(jié)果如表1所示,當(dāng)孵育時(shí)間過少時(shí),羅丹明B與抗體反應(yīng)不充分,猝滅效應(yīng)不明顯,檢測(cè)層中的熒光亮度過強(qiáng);當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí),則會(huì)出現(xiàn)非特異性吸附過強(qiáng)的現(xiàn)象,導(dǎo)致檢測(cè)層中的熒光梯度變差。因此,1.0 mL羅丹明B上樣體積孵育時(shí)間控制在50 s時(shí),反應(yīng)較為充分,檢測(cè)層的綠色熒光猝滅現(xiàn)象明顯。

表1 孵育時(shí)間的確定

2.2.4 上樣體積的確定 在實(shí)驗(yàn)中,對(duì)檢測(cè)柱中的羅丹明B的添加量進(jìn)行優(yōu)化,確定其最佳值。對(duì)實(shí)驗(yàn)中除上樣體積之外的條件進(jìn)行固定,對(duì)羅丹明B(濃度為1.0 μg/L)的加入量分別控制在1.0、2.0、3.0、4.0 mL,按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作,在紫外分析儀365 nm的UV光照下觀察。在羅丹明B的加入量為3.0 mL的條件下,檢測(cè)層中的猝滅現(xiàn)象顯色效果明顯。若羅丹明B上樣量不足,則檢測(cè)層中與量子點(diǎn)的熒光猝滅反應(yīng)不完全,梯度也不好,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;若羅丹明B上樣量過大,熒光猝滅現(xiàn)象也比較明顯,但會(huì)造成實(shí)驗(yàn)成本浪費(fèi)檢測(cè)梯度變差,故確定3.0 mL為羅丹明B上樣量的最優(yōu)值,結(jié)果見表2。

表2 上樣體積的確定

2.3 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)限的確定

將羅丹明B溶液配制成不同的濃度梯度,分別為0、1.0、2.0、5.0 μg/L,在其他實(shí)驗(yàn)因素均固定且處于最優(yōu)值的條件下,對(duì)各個(gè)濃度的羅丹明B溶液進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)柱中,綠色熒光亮度發(fā)生猝滅現(xiàn)象時(shí)羅丹明B濃度最低值即為本方法針對(duì)羅丹明B的檢測(cè)限。結(jié)果如圖4所示,在羅丹明B濃度為1.0 μg/L時(shí),檢測(cè)柱出現(xiàn)明顯的綠色熒光猝滅現(xiàn)象,即本方法針對(duì)羅丹明B的檢測(cè)限為1.0 μg/L。

圖4 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)限的確定

2.4 樣品分析

為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性,將所建立的基于量子點(diǎn)的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱與高效液相色譜方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果如表3所示,兩種檢測(cè)結(jié)果顯示出較好的一致性,說明所建立的方法具有很好的實(shí)用性。此外,當(dāng)用所建立的方法測(cè)定添加量小于5.0 μg/kg的樣品,檢測(cè)層沒有出現(xiàn)明顯的綠色熒光淬滅現(xiàn)象,證明該方法的樣品檢測(cè)限為5.0 μg/kg。

表3 高效液相色譜法和本研究所提出方法檢測(cè)番茄醬中羅丹明B(n=3)

3 結(jié)論

本研究利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理建立了一種針對(duì)番茄醬中羅丹明B快速檢測(cè)的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測(cè)柱方法。在最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,方法針對(duì)羅丹明B的檢測(cè)限為1.0 μg/L,樣品檢測(cè)限為5.0 μg/kg,且將所建立的方法與高效液相色譜的方法進(jìn)行對(duì)比,二者具有很好的一致性。該方法檢測(cè)靈敏度高,檢測(cè)速度快,非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本研究能夠?yàn)榉厌u中違禁添加物羅丹明B的快速分析檢測(cè)提供新思路。