功能化納米金修飾電極檢測食品中H2O2的殘留量

陳林林,范天嬌,李 偉,吳嘉樹,韓 可,辛嘉英,2

(1.哈爾濱商業大學省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

過氧化氫俗稱雙氧水,化學式H2O2[1],由于其強氧化性可用于傷口、環境中的消毒,過氧化氫也廣泛地應用于食品中,如食品漂白、食品防腐以及食品加工過程中包裝消毒和乳制品生產過程中的消毒[2-4]。但過多的過氧化氫不僅會引起微生物突變,還會引起癌癥,導致胃腸道損傷等。因此食品中的過氧化氫含量必須受到嚴格的控制,生命科學和食品工業領域都將過氧化氫的檢測視為重點研究課題[5-6]。

到目前為止,許多學者對過氧化氫的檢測方法進行了研究,包括熒光光譜、碘量法、容量分析、分光光度法、高效液相色譜法、電化學傳感器等,并對這些檢測方法進行了優化[7-12]。Tang等[13]制備熒光碳點,利用比色法檢測過氧化氫,檢出限為1.75 μmol/L。Lu等[14]利用二氧化錳納米結構修飾在多壁碳納米管表面建立過氧化氫傳感器檢測限為6.97 μmol/L,且穩定性高、選擇性好、檢測H2O2的貨架期長。Niu等[15]通過建立過氧化氫傳感器實現了在0.5～5 μm范圍內高選擇性地檢測外源性H2O2,并可在30 s內快速檢測大腸桿菌中的H2O2。池泉[16]利用羅丹明實現了熒光的方法對過氧化氫的檢測,檢出限較低,應用于雨水中過氧化氫的檢測。Wang等[17]利用分光光度法實現了實際水樣中的低濃度H2O2的準確測定。但這些方法都存在著靈敏度不高,操作復雜以及對儀器要求較高等不足。

由于納米金具有良好的導電性,它可以加速電極表面的電子轉移速度,因此納米金固定在電極表面可以使電極表面的電子與被檢測物質的傳遞速度加快[18]。納米金粒子還能夠催化很多物質的氧化還原反應并且在電化學中表現出催化活性。因此,納米金在電化學領域的應用前景十分廣闊。竇博鑫等[19]利用層層自組裝的方法將功能化納米金修飾在電極上,配位Cu2+后制作了一種新型過氧化氫傳感器,表現出較強的還原過氧化氫催化活性。Manickam等[20]利用納米金、殼聚糖和環糊精制備了水凝膠納米復合材料,從而制備了一種靈敏度較高的過氧化氫生物傳感器。

本實驗利用電沉積的方法,將甲烷氧化菌素、半胱氨酸、色氨酸等功能化物質對檸檬酸鈉還原法制備的納米金進行功能化,通過循環伏安(CV)和交流阻抗(EIS)兩種方式考察功能化物質、納米金粒徑、半胱氨酸濃度、掃描速度、緩沖溶液濃度對過氧化氫在修飾電極上的電化學行為,篩選出最佳電極修飾和檢測過氧化氫的條件,并利用此電極建立檢測過氧化氫的線性關系,繪制標準曲線,評價該修飾電極對過氧化氫的檢測性能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-巰基乙胺、β-環糊精、氯金酸 源葉生物有限公司;檸檬酸鈉 天津市光復精細化工研究所;L-半胱氨酸 上海伯奧生物科技有限公司;色氨酸 北京芳草醫藥化工發展有限公司;自來水 哈爾濱市當地自來水;商用飲用水 超市購買農夫山泉礦泉水;牛奶 超市購買蒙牛純牛奶。

CHI660A型電化學工作站 上海辰華儀器公司;BSA224S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金(AuNPs)的制備 利用檸檬酸鈉還原法[21]制得五種不同粒徑AuNPs溶液,分別為10、13、15、17、20 nm。

1.2.2 修飾電極的制備 根據文獻[22]進行裸電極的制備,配制色氨酸(Try)溶液、L-半胱氨酸溶、L-半胱氨酸(L-Cys)溶液和5 mmol/L的巰基乙胺溶液、0.01 mol/的L-半胱氨酸溶液和3 mmol/L的環糊精(CD)溶液,以及實驗室進行培養和純化的甲烷氧化菌素(Methanobactin,Mb)[23]。將拋光好的五根裸電極分別置于配制好的溶液中,利用電沉積的方法掃描電位為-0.6～0.4 V,循環伏安(CV)掃描20圈,將上述電極置于納米金溶液中以上述的相同條件粒徑進行循環伏安掃描20圈,在電解液中以電位窗口為-0.3～0.6 V,0.05 V/s掃描速度循環伏安掃描2圈并利用交流阻抗(EIS)進行表征。

1.2.3 過氧化氫在修飾電極上的電化學行為考察

1.2.3.1 修飾電極功能化物質的選擇 分別將色氨酸、Mb(0.025 mol/L)、半胱氨酸、半胱氨酸/巰基乙胺功能化納米金、半胱氨酸/環糊精功能化納米金等5種修飾電極置于0.1 mol/L的過氧化氫與pH7.8的PBS緩沖液以3∶1體積比的混合液中進行電位窗口為-0.3～0.6 V,掃描速度是0.05 V/s的循環伏安掃描并利用交流阻抗表征。

1.2.3.2 修飾電極納米金粒徑的選擇 將10、13、15、17、20 nm粒徑的納米金修飾電極于0.1 mol/L的過氧化氫與pH7.8的PBS緩沖液以3∶1體積比的混合液中進行電位窗口為-0.3～0.6 V,掃描速度是0.05 V/s的循環伏安掃描并利用交流阻抗表征。

1.2.3.3 修飾電極功能化物質濃度的選擇 將0.0025、0.004、0.005、0.01、0.02 mol/L的半胱氨酸修飾電極分別于0.1 mol/L的過氧化氫與pH7.8的PBS緩沖液以3∶1體積比的混合液中進行電位窗口為-0.3～0.6 V,掃描速度是0.05 V/s的循環伏安掃描并利用交流阻抗表征。

1.2.3.4 修飾電極電沉積法掃描速度的選擇 將掃描速度為90、100、110、120、130 mV/s修飾的電極分別置于0.1 mol/L的過氧化氫與pH7.8的PBS緩沖液以3∶1體積比的混合液中進行電位窗口為-0.3～0.6 V,掃描速度是0.05 V/s的循環伏安掃描并利用交流阻抗表征。

1.2.3.5 修飾電極檢測體系緩沖溶液pH的選擇 將根據選擇的修飾條件修飾的電極于0.1 mol/L的過氧化氫與pH為5.0、6.0、6.7、7.8、8.5的PBS緩沖液以3∶1體積比的混合液中進行電位窗口為-0.3～0.6 V,掃描速度是0.05 V/s的循環伏安和交流阻抗表征。

1.2.4 修飾電極檢測過氧化氫方法學的考察

1.2.4.1 修飾電極檢測過氧化氫標準曲線的制作 將修飾的電極于1 mL pH6.0的PBS緩沖液中加入3 mL濃度分別為0.1、0.08、0.05、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001 mol/L 的過氧化氫溶液,進行電位窗口為-0.3～0.6 V,掃描速度0.05 V/s的循環伏安掃描2圈進行過氧化氫的檢測。利用選取的過氧化氫濃度(mol/L)與循環伏安掃描的氧化峰電流(A)繪制檢測過氧化氫的標準曲線。

1.2.4.2 檢出限與定量限 連續測定不加樣的空白數據二十次,以空白值標準偏差的3倍與標準曲線的斜率比值計算出檢出限(LOD),以空白值標準偏差的10倍與標準曲線的斜率比值計算出定量限(LOQ)。

1.2.4.3 精密度與穩定性實驗 采用同一根功能性納米金修飾電極檢測過氧化氫5次,用平行制備的5根電極對過氧化氫進行檢測,確定方法的精密度與穩定性。

1.2.4.4 修飾電極的抗干擾性能檢測 考察葡萄糖、甘氨酸、組氨酸、抗壞血酸、精氨酸、鉀鹽和鈉鹽對功能性納米金修飾電極檢測過氧化氫的影響情況。采用電流-時間曲線法在-0.3 V的電位下測試。

1.2.4.5 方法的加樣回收實驗 為考察AuNPs/巰基乙胺/Cys/金電極在實際樣品檢測中的適用性,采用標準加入法,于3 mL自來水、商用飲用水、牛奶中分別加入200 μ L的 H2O2標準溶液,計算方法的加樣回收率。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次,不同組的數據使用SPSS 17.0軟件采用LSD法進行顯著性差異分析,顯著性水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 過氧化氫在修飾電極上的電化學行為

2.1.1 功能化物質對修飾電極檢測過氧化氫的影響 不同功能化物質修飾電極過氧化氫行為的峰電流如圖1所示,其中Cys/巰基乙胺/AuNPs的修飾電極峰電流較高,平均值為3.596×10-6A,與其他各功能化物質修飾電極檢測過氧化氫峰電流存在顯著性差異(P<0.05),電信號有明顯的增強。可知L-半胱氨酸與巰基乙胺可以對電子轉移起到良好的促進作用,因此認為Cys/巰基乙胺/AuNPs修飾電極對過氧化氫的檢測效果較優。

圖1 不同功能化物質對修飾電極在H2O2溶液中氧化峰電流的影響

從圖2的交流阻抗圖可以看出,Cys/巰基乙胺/AuNPs修飾電極的的阻抗弧半徑較小,它的大小決定了過氧化氫在電極表面的電子轉移動力學,說明該功能化物質修飾電極對異向電子阻礙作用較小,修飾效果較好,Try/AuNPs修飾電極的阻抗弧半徑較大,說明該功能化物質在金電極上修飾效果較差,與圖1顯示的結果一致。進一步說明對于修飾電極功能化物質的選擇是合適的。與李明芳等[24]研究苯二酚測定所選用的功能化物質是相似的。

圖2 不同功能化物質修飾電極在H2O2溶液中的EIS圖譜

2.1.2 納米金粒徑對修飾電極檢測過氧化氫的影響 如圖3所示,修飾電極的納米金粒徑從10～15 nm,CV檢測過氧化氫的峰電流有明顯的上升趨勢,從15～20 nm峰電流有明顯降低趨勢。不同粒徑納米金修飾電極檢測過氧化氫峰電流均具有顯著性差異(P<0.05)。15 nm修飾電極峰電流平均值較高為3.714×10-6A。可能是由于15 nm納米金的小尺度,提供了更大的電極表面積,使其對電子的傳遞作用更好,使峰電流明顯增加。可以認為15 nm納米金修飾電極效果較優。

圖3 不同粒徑納米金對修飾電極在H2O2溶液中氧化峰電流的影響

如圖4交流阻抗圖中可以看出,由于納米金粒子的良好導電性及其小尺度,降低了電極的電阻,而15 nm的納米金修飾電極的阻抗弧半徑較小,證明其異向電子阻礙作用較小,從15～20 nm阻抗弧半徑越來越大,從10～15 nm阻抗弧半徑越來越小,與圖3顯示的結果一致,因此可以選擇粒徑大小為15 nm的納米金。

圖4 不同納米金粒徑修飾電極在H2O2溶液中的EIS圖譜

2.1.3 半胱氨酸濃度對修飾電極檢測過氧化氫的影響 如圖5,修飾了半胱氨酸濃度為0.005 mol/L電極的氧化還原峰電流平均值為9.570×10-6A,不同濃度半胱氨酸修飾電極檢測過氧化氫的峰電流存在顯著差異(P<0.05),半胱氨酸濃度在0.005～0.02 mol/L范圍內峰電流逐漸下降,從0.0025～0.005 mol/L逐漸上升,可以看出濃度對半胱氨酸促進過氧化氫的催化氧化作用顯著,認為半胱氨酸濃度為0.005 mol/L的修飾效果較好。

圖5 不同濃度半胱氨酸對修飾電極在H2O2溶液中氧化峰電流的影響

如圖6所示,不同的半胱氨酸濃度的交流阻抗圖可以看出,半胱氨酸濃度從0.005～0.02 mol/L阻抗弧半徑有變大趨勢,從0.0025～0.005 mol/L阻抗弧半徑有變小趨勢,半胱氨酸濃度為0.005 mol/L時阻抗弧半徑較小,異向電子的阻礙作用較小,半胱氨酸濃度為0.005 mol/L的電極修飾條件較優，與圖5所得結果一致。

圖6 不同功能化物質濃度修飾電極在H2O2溶液中的EIS圖譜

2.1.4 電沉積法掃描速度對修飾電極檢測過氧化氫的影響 如圖7,掃描速度為110 mV/s的修飾電極的氧化還原峰電流平均值為9.428×10-6A,不同掃描速度修飾電極檢測過氧化氫的峰電流存在顯著差異(P<0.05),且從90～110 mV/s峰電流有上升趨勢,從110～130 mV/s峰電流有降低趨勢,110 mV/s的修飾條件峰電流較大。這表明過氧化氫在電極上的電化學反應主要受吸附控制,如果掃描速度過小,峰電流的變化較弱,如果掃描速率太大,導致電極充電電流過大,進而導致電極被擊穿,因此可以認為110 mV/s掃描速度的修飾效果較好。

圖7 不同掃描速度對修飾電極在H2O2溶液中氧化峰電流的影響

從圖8交流阻抗圖中可以看出,電沉積法修飾電極的掃描速度為110 mV/s的阻抗弧半徑較小,其趨勢與圖7中的趨勢具有一致性,進一步證明掃描速度的選擇是合適的。

圖8 不同掃描速度修飾電極在H2O2溶液中的EIS圖譜

2.1.5 體系pH對檢測過氧化氫的影響 如圖9,pH5.0、pH6.0、pH6.7的檢測條件檢測過氧化氫的氧化還原峰電流之間存在顯著差異(P<0.05),pH7.8與pH8.5檢測條件差異不顯著(P>0.05),pH為6.0時修飾電極檢測過氧化氫的氧化還原峰電流較高,平均值為1.928×10-5A。在pH5.0～8.5的范圍內,峰電流先增大后減小,這可能是由于質子參與了過氧化氫在電極上的氧化還原反應,所以為了提高檢測的靈敏度,選擇pH為6.0的檢測體系。

圖9 不同緩沖溶液pH對修飾電極在H2O2溶液中氧化峰電流的影響

如圖10,交流阻抗圖中pH6.0的阻抗弧較小,說明修飾效果更好,交流阻抗阻抗弧大小趨勢與圖9所呈現的趨勢均一致,進一步證明體系pH對過氧化氫檢測效果的影響較大,pH6.0對過氧化氫的檢測效果較優。與曹挺等[25]的實驗結果一致。

圖10 不同緩沖溶液pH對修飾電極在H2O2溶液中EIS的影響

2.2 修飾電極檢測過氧化氫的方法學考察

2.2.1 標準曲線的制作 如圖11所示,隨著過氧化氫濃度的升高,氧化還原峰電流出現了明顯的升高,因此可以確定過氧化氫濃度與峰電流之間存現明顯的線性關系,得到線性回歸方程為y=5.82x+1.35,相關系數r=0.997,說明過氧化氫濃度與峰電流的線性關系良好。

圖11 修飾電極檢測過氧化氫標準曲線

2.2.2 檢出限與定量限 計算可得檢出限達0.129 μmol/L,低于Wang等[26]、王任等[27]、Abdolmohammad-Zadeh等[28]檢測過氧化氫的檢出限,定量限為0.431 μmol/L。

2.2.3 修飾電極的精密度與穩定性實驗 采用同一根功能性納米金修飾電極檢測過氧化氫5次,電流響應的標準偏差(RSD)為3.86%,用平行制備的5根電極對過氧化氫進行檢測,電流響應的標準偏差(RSD)為4.42%,可證明該修飾電極檢測過氧化氫具有良好的精密度和穩定性。

2.2.4 修飾電極的抗干擾性能 由圖12,加入過氧化氫100倍濃度的精氨酸,峰電流僅從-2.726×10-7A降至-2.731×10-7A,加入過氧化氫100倍濃度的KCl溶液峰電流僅從-2.686×10-7A降至-2.697×10-7A,與曹嬙等[29]文獻中檢測過氧化氫抗離子干擾實驗所用10倍過氧化氫濃度的離子濃度I-t曲線比較,可以證明該修飾電極對葡萄糖、甘氨酸、組氨酸、抗壞血酸、精氨酸、鉀鹽和鈉鹽的催化性能,即上述物質對過氧化氫的檢測結果影響較小,表明該電極在過氧化氫的檢測上具有較優的抗干擾能力。

圖12 修飾電極抗離子干擾I-t曲線

2.2.5 方法的加樣回收率 通過于3 mL實際樣品中添加200 μL的過氧化氫進行分析并計算回收率,結果如表1。可得回收率在92.1%～95.6%之間,RSD在2.26%～4.52%之間,表明該方法可用于實際樣品中過氧化氫的檢測。

表1 修飾電極檢測方法的加樣回收率

3 結論

采用電沉積的方法修飾電極,通過考察對修飾修飾電極在修飾電極上的電化學行為,最終得到優化條件,優化條件下修飾電極檢測過氧化氫的相關系數r=0.997,線性關系良好,檢出限可達0.129 μmol/L,定量限可達0.431 μmol/L,具有較高的精密度以及較優穩定性和抗離子干擾能力,同時通過加標回收實驗考察了檢測方法的準確度,因此,該方法對真實樣品和其他干擾物質的檢測具有良好的靈敏度和選擇性,可以被認為是一種具有高靈敏度和高選擇性的過氧化氫檢測方法,可用于食品中微量殘留過氧化氫的含量測定,并為食品以及飲用水中過氧化氫殘留量的檢測提供了參考依據。