紅曲菌發酵辣木葉顆粒劑制備工藝及其抗氧化活性的研究

張文州,彭 飛,林水森,莊月娥,陳琳琳,謝志新

(泉州醫學高等專科學校,福建泉州 362000)

辣木(MoringaoleiferaLam.)又稱鼓槌樹,是一種重要的經濟植物,其整株可供食用和藥用,被廣泛應用于藥品、保健品、食品、化妝品等領域[1-4]。自從2012年我國衛生部將辣木葉作為新資源食品以來,我國辣木種植、產品研發及銷售等均取得很大的發展,目前已有的辣木產品包括辣木葉片劑、辣木罐頭、辣木面包和辣木強化食品等,極大豐富了辣木資源的應用[5-6]。

辣木葉作為辣木資源之一,具有不耐貯藏、口感不佳、服用不方便等缺點。本研究從微生物角度出發,考慮到將微生物和辣木葉相結合的方式,對其發酵產物進行深加工,為辣木產品開發提供了新思路。在眾多發酵菌種里,紅曲菌因代謝產物豐富、營養價值極高,產生的紅曲色素、多酚類等產物具有較強的抗氧化活性等優勢常被廣泛應用于許多領域[7-12]。Wang等[13]利用番石榴葉、盧紹闖等[14]利用紫蘇,其他學者利用黃精、大豆等材料作為研究對象和紅曲菌進行發酵[15-17]。紅曲菌的發酵產物莫納可林K(Monacolin K,MK)具有良好的降血脂、降膽固醇等功效,Zhang等[18]研究了谷氨酸對不同紅曲菌發酵生產MK的影響,Huang等[19]研究了突變和溫度等條件對紅曲菌產MK的影響以及相關性分析,Kitisart[20]系統研究了乙醇濃度對MK產量以及對抗氧化活性的影響,Liu等[21]基于轉錄組研究分析了紅曲菌合成MK和色素的機制。但紅曲菌發酵過程容易產生桔霉素,它是一種真菌毒素,具有顯著的致癌、致畸、引發各類疾病的危害,國外一些國家將紅曲菌發酵產品中的桔霉素含量作為嚴格控制指標,從而保證紅曲產品食用和藥用的安全性[22-24]。

因此,本研究擬使用紅曲菌發酵作為辣木葉的加工方式,針對紅曲菌發酵辣木葉過程的各因素進行試驗優化,并進一步將發酵產物制備成顆粒劑。通過測定產品的抗氧化活性和桔霉素含量評價產品質量,以期有效地解決辣木葉存在的問題,便于直接服用和沖泡,同時又豐富了辣木葉的應用范圍,為辣木的產業化應用提供了一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲菌YGZ-101 福建微生物研究所提供;辣木葉 采自永春縣,由泉州醫學高等專科學校中藥教師林水花鑒定;大米 市售;乙腈(色譜純)、氯化鈣、瓊脂、冰醋酸、磷酸二氫銨、MgSO4·7H2O、抗壞血酸、無水乙醇、Tris-HCl緩沖液、葡萄糖、蛋白胨(均為分析純) 西隴化工有限公司;洛伐他汀(色譜純) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;菌種活化培養基:馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基 杭州天和微生物試劑有限公司;種子培養基:葡萄糖50 g,蛋白胨10 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NH4H2PO42 g,CaCl20.1 g,定容至1000 mL,pH6.0,121 ℃滅菌20 min;紅曲菌液體培養基:葡萄糖4%,酵母浸粉1%,蛋白胨2%,pH6.0,121 ℃滅菌20 min。

Agilent 7890A高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;JA12002電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;EYELA N-1100旋轉蒸發儀 上海愛明儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環真空式水泵 上海羌強實業發展有限公司;DXF-20D高速萬能粉碎機 廣州大祥電子機械設備公司;KYC-100B恒溫振蕩培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司;LHS-100CH恒溫恒濕箱 上海一恒科學儀器有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原材料準備 將辣木葉清理,并用流水洗凈后放入60 ℃的烘箱中干燥2 h,使其得到充分的干燥。測干燥后的辣木葉水分含量為6.7l%。經過高速萬能粉碎機粉碎,收集辣木葉粉,并過100目篩,4 ℃保存待用。

1.2.2 發酵培養基制備 將大米、辣木葉粉混合物與蒸餾水以2∶1 g/mL的比例裝入250 mL三角瓶中,室溫浸泡12 h,每瓶裝量20 g,蒸餾水10 mL,121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 紅曲菌發酵辣木葉工藝 大米、辣木葉拌勻→裝瓶→滅菌→冷卻→接種、發酵→干燥→產品

大米和辣木葉拌勻加入蒸餾水后裝入250 mL三角瓶中,室溫浸泡12 h,121 ℃滅菌20 min,冷切后于超凈工作臺接種紅曲菌菌懸液(約107cell/mL),置于恒溫培養箱中培養20 d后取出干燥,待用。

1.2.4 發酵條件優化的正交試驗 依據參考文獻[25-28]結果,選取接種量(A)、辣木葉添加量(B)、發酵溫度(C)、初始含水量(D)四因素作為紅曲菌發酵辣木葉過程的考察因素,設計L9(34)正交試驗,以MK的產量作為評價指標,見表1。

表1 正交實驗因素與水平表

1.2.5 紅曲樣品中MK的測定 Monacolin K檢測采用HPLC(QB/T 2847-2007)方法,標準曲線線性回歸方程:y=46986x-25598,R2=0.9997,其中橫坐標為MK的濃度(mg/L),縱坐標為峰面積,R為相關系數。

1.2.6 顆粒劑制備的主要工藝 物料準備→成型工藝的篩選→制軟材→制顆粒→干燥→整粒→質量檢查→產品。

采用濕法制粒,準確稱取紅曲菌發酵辣木葉的發酵產物和輔料,混勻,乙醇做潤濕劑制軟材,利用1號篩制粒,濕顆粒置于60 ℃烘箱烘干燥2 h后過2號篩整粒,得顆粒劑,將制備好的顆粒劑裝入自封袋置于干燥器中保存,待用,根據試驗要求對顆粒劑進行質量檢查。

1.2.7 顆粒劑考察指標的測定及綜合評分方法 參照張文州等[29]的方法,對吸濕性、休止角和成型率等考察指標進行測定。采用百分制的綜合評分方法對顆粒劑的質量進行考察,其中吸濕性占30分,休止角占30分,成型率占40分,綜合評分的分值=(30×最小吸濕率)/吸濕率值+(30×最小休止角)/休止角值+(40×成型率值)/最大成型率。

1.2.8 不同釋釋劑的選擇 參照王秀麗等[30]的研究結果,選取發酵產物:輔料(1∶2)進行單一輔料的篩選,測定成品的吸濕性、休止角和成型率,以綜合評分為評價指標,篩選出糊精、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉中的最佳單一輔料,根據最佳單一輔料結果進一步研究確定混合輔料的最佳配比。

1.2.9 單因素實驗 根據1.2.8的結果確定乳糖和淀粉作為混合輔料做進一步研究。以綜合評分為考察評價標準,發酵產物∶輔料比值設為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5時,乙醇體積分數為90%,乙醇用量為0.8 mL/g,乳淀比為1∶1;乙醇體積分數設定為60%、70%、80%、90%、100%時,發酵產物∶輔料比值設為1∶1,乙醇用量為0.8 mL/g,乳淀比為1∶1;乙醇用量設為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/g時,發酵產物∶輔料比值設為1∶1,乙醇體積分數為90%,乳淀比為1∶1;混合輔料乳糖和淀粉的配比(乳淀比)設為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1時,發酵產物∶輔料比值設為1∶1,乙醇體積分數為90%,乙醇用量為0.8 mL/g,分別做單因素實驗。

1.2.10 正交設計試驗優選顆粒劑成型工藝 根據單因素實驗結果,選取A(發酵產物∶輔料)、B(乙醇體積分數,%)、C(乙醇用量,mL/g)、D混合輔料乳糖和淀粉的配比(乳淀比)作為考察因素,以綜合評分為評價指標,設計L9(34)正交試驗,見表2。

表2 正交試驗因素與水平表

1.2.11 DPPH自由基清除能力對比 DPPH自由基清除能力的測定方法參照張文州等[31]方法。實驗設計以不添加辣木葉的紅曲菌發酵大米的產物作為空白對照,比較發酵前后產品的DPPH自由基清除能力,維生素C作為陽性對照,維生素C和發酵前后產品以純水為溶劑,濃度均配制為0.15 mg/mL。

1.2.12 桔霉素檢測 采用HPLC檢測桔霉素,檢測發酵后產品中的桔霉素含量,以添加桔霉素的發酵樣品作為對照,桔青霉素檢測參照GB 5009.222-2016方法測定。

1.3 數據處理

實驗操作重復3次,采用DPS軟件9.01版對實驗結果進行處理,并用Tukey法作多重數據比較,進行正交實驗方差分析。

2 結果與分析

2.1 紅曲菌發酵辣木葉條件正交試驗優化結果

根據表3可知,四個因素影響大小為:B>D>A>C,所得最佳的發酵工藝為A3B2C1D2,即接種量8%、辣木葉添加量20%、發酵溫度28 ℃、初始含水量40%。因發酵溫度C的極差值最小,所以將其作為誤差,進行多重數據分析,由表4可知各因素對結果無顯著性影響。

表3 正交試驗結果

表4 方差分析

根據最佳工藝條件,即選取接種量8%、辣木葉添加量20%、發酵溫度28 ℃、初始含水量40%,MK的產量為6.92 mg/g,說明優選的發酵條件穩定性良好。

2.2 單一輔料篩選結果

從表5結果可知,四種輔料中,吸濕率最低的輔料為乳糖(13.42%),休止角最小的輔料為可溶性淀粉(36.47°),成型率最高的為乳糖(92.63%)。綜合評分的結果,乳糖作為輔料的分值最高為99.24分,可溶性淀粉分值第二高為95.32分。因此,選取乳糖和可溶性淀粉作為混合輔料的材料,研究確定最適混合比例。

表5 單一輔料的篩選結果

2.3 單因素實驗結果

由表6可知,當發酵產物∶輔料的比值為1∶1時,綜合評分最高達98.33分;乙醇體積分數為90%時,分值最高為99.55分;乙醇用量為0.8 mL/g時,綜合評分最高為99.28分;乳淀比為1∶1時,綜合評分最高。因此,選取各因素綜合評分最高的水平作為正交試驗的各因素的中間水平,對顆粒劑成型工藝做正交試驗優化。

表6 單因素實驗結果

2.4 正交試驗優選顆粒劑成型工藝結果

正交試驗優選顆粒劑成型工藝實驗結果如表7所示,各因素影響大小順序為:A>D>B>C,最佳的發酵工藝為A3B2C3D3,即發酵產物:輔料為1∶1.5、乙醇體積分數90%、乙醇用量0.9 mL/g、乳淀比2∶1。因乙醇用量C的極差值最小,所以將其作為誤差,進行多重數據分析,由表8可知各因素對結果無顯著性影響。

表7 正交試驗結果

表8 方差分析

根據最佳工藝條件,即選取發酵產物:輔料(1∶1.5)、乙醇體積分數(90%)、乙醇用量(0.9 mL/g)、乳淀比(2∶1),結果為吸濕率為13.34%,休止角為31.62°,成型率為92.55%,綜合評分為99.72分。所得結果較正交試驗最高分數對應的評價指標均有所提高,說明優選的顆粒劑工藝條件穩定可行。

2.5 DPPH自由基清除效果對比

由表9結果可知,添加辣木葉對紅曲菌進行發酵,發酵后產品的DPPH自由基清除率達56.69%,均高于對照和未發酵產品,同濃度的維生素C對照液的DPPH自由基清除率為69.27%,高于發酵后產品。發酵產物的DPPH自由基清除率的提高,可能是發酵促進了紅曲菌產生了抗氧化的代謝產物,從而提高了發酵后產品的抗氧化效果,這與Qin等[9]的研究結果一致。

表9 不同項目DPPH自由基清除能力結果

2.6 桔霉素檢測結果

桔霉素是紅曲發酵過程中產生的主要有害成分,檢測其含量至關重要。由圖1、圖2中可知,紅曲菌發酵辣木葉的產物經檢測未發現桔霉素存在,發酵過程紅曲菌性質穩定,安全性良好。

圖1 桔霉素添加到發酵樣品中的HPLC圖

圖2 發酵樣品檢測桔霉素的HPLC圖

3 討論

隨著辣木產業在我國各個區域的大量發展,獲取的辣木資源特別豐富,但是存在著如何深加工辣木資源和充分展現辣木的最大價值問題。Ajuogu等[32]研究了辣木葉對生殖活動的影響,Shi等[33]利用蛋白質組學研究分析了辣木葉提取成分,但是目前利用微生物發酵辣木葉開發顆粒劑產品較少。考慮到紅曲菌的應用廣泛,本研究將紅曲菌和辣木葉有機結合,為紅曲菌的發酵提供了新的對象,也為辣木資源的深度開發提供了一條新的途徑。本研究通過單因素實驗和正交試驗,系統考察紅曲菌發酵過程中各因素對MK產量的影響,得到紅曲菌發酵辣木葉最佳的發酵條件,MK的產量為6.92 mg/g。通過單因素實驗和正交試驗,優選出最佳可溶性顆粒劑工藝配方,吸濕率為13.34%,休止角為31.62°,成型率為92.55%,綜合評分達99.72分,工藝條件穩定可行。

試驗還研究了所得發酵產品的抗氧化活性,結果表明紅曲菌發酵辣木葉后的產品對DPPH自由基清除率達56.69%,均高于空白對照和未發酵產品,但低于陽性對照組維生素C的清除能力。說明了利用紅曲菌發酵辣木葉獲得的產品具有較強的抗氧化功能,其抗氧化活性與紅曲菌發酵辣木葉之間的關系需進一步研究。紅曲菌的發酵過程,可能產生的桔霉素極大地制約了紅曲廣泛利用,因此產品的發酵過程中要注意對桔霉素含量的監控,本研究未發現紅曲菌發酵辣木葉的產物中含有桔霉素,說明發酵過程紅曲菌性質穩定,安全性良好。

本研究將辣木葉和紅曲菌的發酵產物制備成顆粒劑,為紅曲和辣木資源的的市場化產品開發提供了研究基礎,對促進紅曲和辣木資源的市場化具有重要意義。但是顆粒劑只是諸多劑型中應用比較廣泛的一種,下一步將繼續研究性能穩定、用途多樣的其他劑型,同時改進在紅曲菌種的篩選、發酵條件優化、培養基的選擇等方面的研究,以期達到規模化的生產。