刺果番荔枝葉多酚提取工藝優化及其體外抗氧化活性

孔方南,李文硯,韋 優,趙 靜,周 婧,楊志強,張秀芬

(廣西南亞熱帶農業科學研究所,廣西龍州 532415)

刺果番荔枝(AnnonamuricataL.)又名紅毛榴蓮,番荔枝科番荔枝屬,落葉喬木,原產于熱帶美洲,我國廣東、廣西、云南、海南等地均有引種栽培。刺果番荔枝果實口感清甜,含有必需氨基酸、蛋白質、礦物質、維生素等[1],具有美容養顏、清熱解毒等功效[2-3]。刺果番荔枝的葉片、根、莖、種子中含有番荔枝內酯類化合物、生物堿類、酚類等有效成分,具有抗癌、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗瘧等功能[4-5]。同時,刺果番荔枝具備生快長、四季常綠的特性,能夠提供豐富的原材料。研究表明多酚具備極強的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎等活性[6-10],具有醫治心腦血管、調節血壓、血脂等生理作用[11-15];研究發現多酚類化合物可以抑制腫瘤的形成延緩腫瘤的發作[16-17],同時可作為天然抗氧化劑及食品功能成分與其他抗氧化劑起到協同作用,如延長維生素C、維生素E的作用時間[18]。

目前植物多酚還沒有標準化的提取方法,常用的提取方法主要是回流提取法、溶劑法、超聲輔助提取法、酶輔助提取法等[19]。乙醇溶劑溶解性好,對細胞穿透性強,同時降低試驗過程中試劑對人體造成的危害和對環境的污染。目前,國內尚無對刺果番荔枝植物相關部分多酚提取技術的研究。

本試驗采用乙醇溶劑浸提法,從刺果番荔枝葉中提取多酚類物質,通過單因素實驗考察乙醇溶劑體積分數、液料比、提取溫度及提取時間對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響,通過Box-Benhnken中心組合試驗對其提取工藝進行優化,采用體外DPPH自由基和羥自由基(·OH)活性檢測法測定其抗氧化能力。對刺果番荔枝葉多酚進行研究,從而獲取具有多種用途的多酚物質,有利于植物多酚來源的拓寬,為抗氧化功能性食品研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺果番荔枝老葉 三年生,采摘于番荔枝種質資源圃;乙醇 廣東光華科技股份有限公司;沒食子酸、硫酸亞鐵、水楊酸、抗壞血酸 天津市大茂化學試劑廠;無水碳酸鈉 天津博迪化工股份有限公司;過氧化氫、福林酚(folin phenol,FC) 國藥集團化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 上海麥克林生化科技有限公司;實驗室水為超純水。

XM7D-8222電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;FW-100高速萬能粉碎機 北京市永光明;TP-241精密電子天平 丹佛儀器(北京)有限公司;SH2-D(Ⅲ)循環水式真空泵 西安超杰生物科技有限公司;SHA-C水浴恒溫振蕩器 常州市華普達教學儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺果番荔枝葉預處理 將刺果番荔枝葉清水洗凈,陰涼通風處晾干后,置于70 ℃鼓風干燥箱烘干至恒質量,粉碎后80目過篩,密封干燥備用。

1.2.2 多酚提取工藝 精確稱刺果番荔枝葉干粉,置于玻璃具塞三角燒瓶,按照一定液料比添加乙醇溶劑,設置好提取溫度、提取時間，利用恒溫振蕩器提取多酚類物質,真空泵抽濾樣液,取濾液定容得到多酚粗提液。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 乙醇體積分數對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 準確稱取刺果番荔枝葉細粉1.0 g,設置液料比50∶1 mL/g、提取溫度40 ℃、提取時間40 min,其他條件相同。在乙醇體積分數分別為30%、40%、50%、60%、70%下提取,分別抽濾并收集提取液定容,每個處理重復3次,各取1 mL提取液稀釋一定倍數,測定各組刺果番荔枝葉多酚提取量。

1.2.3.2 提取溫度對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 準確稱取刺果番荔枝葉細粉1.0 g,設置液料比50∶1 mL/g、乙醇體積分數50%、提取時間40 min,其他條件相同。在提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃下提取,分別抽濾并收集提取液定容,每個處理重復3次,各取1 mL提取液稀釋一定倍數,測定各組刺果番荔枝葉多酚提取量。

1.2.3.3 液料比對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 準確稱取刺果番荔枝葉細粉1.0 g,設置乙醇體積分數50%、提取溫度40 ℃、提取時間40 min,其他條件相同。在液料比分別為40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1 mL/g下提取,分別抽濾并收集提取液,每個處理重復3次,各取1 mL提取液稀釋一定倍數,測定各組刺果番荔枝葉多酚提取量。

1.2.3.4 提取時間對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 準確稱取刺果番荔枝葉細粉1.0 g,設置乙醇體積分數50%、提取溫度40 ℃、液料比50∶1 mL/g,其他條件相同。在提取時間分別為40、60、80、100、120 min下提取,分別抽濾并收集提取液定容,每個處理重復3次,各取1 mL提取液稀釋一定倍數,測定各組刺果番荔枝葉多酚提取量。

1.2.4 Box-Benhnken中心組合試驗 對乙醇體積分數、液料比和提取時間3個單因素采用Box-Behnken中心組合試驗進行試驗設計,如表1所示。

表1 Box-Benhnken中心組合試驗因素與水平

1.2.5 刺果番荔枝多酚提取量的測定

1.2.5.1 沒食子酸標準曲線 采用福林-酚法測定[20-21]。配制質量濃度為1 mg/mL沒食子酸標準液(稱量沒食子酸50 mg,50 mL蒸餾水溶解并定容),分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,稀釋質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。各取1 mL置于10 mL具塞試管中,滴入10%福林酚試劑1.0 mL,搖勻反應15 min,而后滴入20%碳酸鈉溶液2.0 mL,室溫下避光反應60 min,反應完成后蒸餾水搖勻定容。蒸餾水調零,紫外可見分光光度計測定765 nm處吸光值。重復試驗,平行測定3次,取平均值,建立標準曲線(以沒食子酸溶液質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標),得到線性回歸方程為y=7.2357x+0.0166,R2=0.9992,在0.01～0.06 mg/mL質量濃度范圍內具有較好的線性相關性。

1.2.5.2 刺果番荔枝多酚提取量的測定及計算 移液槍吸取刺果番荔枝葉多酚提取液1.0 mL,置于10 mL具塞試管中,按沒食子酸標準曲線制作的方法進行測定,滴入10%福林酚試劑1.0 mL,搖勻反應15 min,而后滴入20%碳酸鈉溶液2.0 mL,室溫下避光反應60 min,反應完成后蒸餾水搖勻定容。蒸餾水調零,紫外可見分光光度計測定765 nm處吸光值。重復試驗,平行測定3次,取平均值。通過線性回歸方程計算刺果番荔枝葉多酚質量濃度,多酚提取量公式如下:

式(1)

式中:c為多酚質量濃度(mg/mL);v為多酚提取液總體積(mL);n為多酚提取液稀釋倍數;m為樣品重量(g)。

1.2.6 抗氧化性試驗

式(2)

1.2.6.2 羥自由基(·OH)清除率測定 取2 mL刺果番荔枝多酚溶液于具塞試管,其質量濃度分別為25、50、100、150、200、300 μg/mL,依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液2 mL,6 mmol/L雙氧水溶液2 mL,反應15 min,再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL,反應30 min,蒸餾水調零,紫外可見分光光度計510 nm處測定吸光值,記為A溶液[25-26]。采用相同方法用蒸餾水替換水楊酸溶液換為測定吸光值,記為A對照。采用同樣方法用蒸餾水替換多酚溶液測定吸光值,記為A空白。以VC作陽性對照。羥自由基(·OH)清除率按照公式(3)計算:

式(3)

1.3 數據處理

利用Excel 2003和Design-Expert.V 8.0.6軟件進行數據統計分析并制圖,用SPSS 20.0軟件進行差異顯著分析(不同小寫字母表示差異顯著P<0.05,不同大寫字母表示差異極顯著P<0.01),每個試驗重復3次,結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 由圖1可知,隨著乙醇溶劑濃度上升,刺果番荔枝葉多酚提取量呈增大趨勢,當乙醇體積分數50%時多酚提取量最大,為(13.64±0.79) mg/g;乙醇體積分數為50%、60%、70%時,多酚提取量極顯著(P<0.01)高于乙醇體積分數30%時多酚提取量;乙醇體積分數50%多酚提取量顯著(P<0.05)高于乙醇體積分數40%多酚提取量;乙醇體積分數為50%、60%、70%的多酚提取量差異不顯著。以上表明,在一定濃度條件下,乙醇溶劑有效促進多酚類物質的溶解;乙醇溶劑濃度過大時,對氫鍵和疏水鍵的破壞力降低,同時色素、弱極性成分等溶出,抑制了某些多酚類物質的充分溶解[27-29],提取量降低。因此,刺果番荔枝葉多酚提取過程中,為了避免試劑的浪費,乙醇溶劑濃度50%最為適宜。

圖1 乙醇體積分數對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響

2.1.2 提取溫度對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 由圖2可知,隨著提取溫度的上升,刺果番荔枝葉多酚提取量呈增大趨勢,當提取溫度60 ℃時多酚提取量最大,為(17.13±0.84) mg/g,極顯著(P<0.01)高于提取溫度為30、40、50 ℃時多酚提取量;提取溫度60 ℃時多酚提取量與提取溫度70 ℃時多酚提取量差異不顯著。因此,刺果番荔枝葉多酚提取過程中,從低耗能高效率的角度判斷,適宜提取溫度為60 ℃。

圖2 提取溫度對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響

2.1.3 液料比對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 由圖3可知,隨著液料比的增加,刺果番荔枝葉多酚的提取量呈增大趨勢;在液料比60∶1 mL/g時多酚提取量達到最大,為(16.91±0.34) mg/g,極顯著(P<0.01)高于其他液料比的多酚提取量;隨著料液比繼續增大,多酚提取量呈下降趨勢。由于在一定乙醇溶劑體積范圍內,溶液的用量可以促進多酚類物質的溶出,當料液比增加至60∶1 mL/g時,多酚類物質的溶出已到達基本達飽和狀態。而乙醇溶劑用量的增加,致使色素、非多酚雜質等成分繼續溶出[22,27],從而影響了提取效果,導致多酚提取量逐漸降低。因此,刺果番荔枝葉多酚提取過程中,從能耗角度考慮,料液比60∶1 mL/g最為合適。

圖3 液料比對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響

2.1.4 提取時間對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響 由圖4可知,隨著提取時間的延長,刺果番荔枝葉多酚的提取量呈增大趨勢,在提取時間80 min時多酚提取量達到最高,為(17.74±0.86) mg/g,極顯著(P<0.01)高于提取時間40 min時多酚提取量;提取時間60、80、100、120 min之間的多酚提取量差異不顯著。樣品與溶劑在一定提取時間范圍內,接觸時間的延長利于多酚類物質的溶出;但提取時間超過80 min后,多酚類物質不夠穩定,有氧氣進入參與反應,導致多酚類物質氧化分解,與此同時其他雜質成分相繼溶出,從而導致多酚提取量逐漸降低并趨于穩定[21-22,30-31]。因此,刺果番荔枝葉多酚提取過程中,提取時間80 min最為適宜。

圖4 提取時間對刺果番荔枝葉多酚提取量的影響

2.2 Box-Benhnken中心組合試驗結果及數據分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 在單因素實驗基礎上,采用 Box-Benhnken中心組合試驗設計對刺果番荔枝葉多酚提取進行優化。選擇單要素為A乙醇體積分數、B液料比、C提取時間,響應值Y為刺果番荔枝葉多酚提取量,設計出3因素3水平的17組試驗(中心點重復次數為5次)。試驗過程中每個因素水平提取3次,計算得出的平均值即為多酚提取量。通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對試驗數據進行分析。表2為試驗設計及結果,表3以多酚提取量為響應值的方差分析,圖5為試驗設計得到的各響應面結果。

圖5 各要素對多酚提取量的效應面圖和等高線圖

通過Design Expert8.0.6.1軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合,得到與A乙醇體積分數、B液料比、C提取時間3個要素相關的刺果番荔枝葉多酚提取量Y的二次多項回歸模型為:

Y=20.87-0.20A-2.56B-0.58C+0.32AB-0.39AC-0.09BC-2.68A2-0.83B2-1.52C2

式(4)

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 以多酚提取量為響應值的方差分析

2.2.2 效應圖及等高線圖分析 圖5是A乙醇體積分數、B液料比和C提取時間對Y刺果番荔枝葉多酚提取量的效應圖及等高線圖。由圖4a、4c、4e可看出當A、B、C取值較小時效應面曲線較陡,說明此時A、B、C對Y的影響較為明顯;當A、B、C取值較大時效應面曲線較平緩,此時A、B、C對Y影響較小。由圖5b可知,朝著B要素向峰值移動等高線密度顯然高于A沿因素移動的密度,表明液料比對效應值影響更大,與方差分析結果一致。由圖5d可知,朝著A要素和C要素向峰值移動的等高線密度比較大,且A和C取值較小時對Y的影響更大,當乙醇體積分數高于50%時等高線密度變低,表明較高的乙醇體積分數對響應值Y的影響不如較低超聲時間顯著。由圖5f可知,B要素與C要素進行比較,B向峰值方向移動等高線密度顯然較大,提取時間較低時等高線密度較大,當提取時間高于80 min時等高線密度變低,說明較高液料比對響應值的影響顯著。

各要素對響應值的影響能夠被效應面直觀體現出來,效應面越陡則證明相關因素的交互作用越強[32],交互效應的大小由等高線的形狀體現,兩因素的交互作用的強弱由橢圓形或圓形反映。各要素大小從四周向中心點聚攏時,效應圖呈凸起趨勢,即多酚提取量趨于最大化,表明存在最大響應值。圖5b、圖5d可看出等高線呈現明顯的橢圓形、響應曲線相對較陡,說明A乙醇體積分數和B液料比、A乙醇體積分數和C提取時間之間交互作用顯著,與方差分析結果一致。

2.2.3 刺果番荔枝葉多酚提取工藝優化及驗證結果 利用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件進行回歸分析,刺果番荔枝葉多酚用乙醇浸提法提取的理論最優工藝為:乙醇體積分數55.23%、液料比50∶1 mL/g、提取時間95.76 min,由此工藝得到刺果番荔枝葉多酚提取量的理論預測值為20.11 mg/g。

根據試驗操作的需要,提取工藝調整為:乙醇體積分數55%、料液比50∶1 mL/g、提取時間96 min。在該工藝下提取刺果番荔枝葉多酚,試驗重復3次,得到刺果番荔枝葉多酚提量為(20.37±0.34) mg/g,接近于理論值。表明,運用Box-Benhnken中心組合試驗設計所得的模型參數準確可靠,優化刺果番荔枝葉多酚提取工藝方法可行。

2.3 抗氧化性試驗

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力 DPPH自由基作為具備高度氧化性的自由基,但多酚可通過提供氫原子或螯合劑來抑制氧化反應,具備清除自由基功能[33]。由圖6可看出,刺果番荔枝葉多酚隨著濃度的增加對DPPH具有較強的清除能力,清除率逐漸提升后最后趨于穩定,試驗范圍內的最大清除率為(51.34%±2.68%)。將刺果番荔枝葉多酚及抗壞血酸的質量濃度與其DPPH自由基清除率進行線性擬合,都呈良好的量效關系,擬合方程分別為y=0.344x+15.195(R2=0.968)和y=0.359x+44.303(R2=0.911)。刺果番荔枝葉多酚的半抑制濃度(IC50)為133.33 μg/mL,抗壞血酸的IC50為16.39 μg/mL。在試驗濃度范圍內,同濃度抗壞血酸對照可見,抗壞血酸對DPPH的清除率高于同濃度的刺果番荔枝葉多酚提取物,說明刺果番荔枝葉多酚提取物對DPPH具有較好的清除能力,但不及同濃度的抗壞血酸。

圖6 不同質量濃度刺果番荔枝葉多酚對DPPH自由基清除能力

2.3.2 對羥自由基(·OH)的清除能力 羥基自由基是反應性強的氧化劑,它能夠與細胞成分發生反應,對機體產生危害,導致引發各種疾病和加速機體衰老[34-35]。圖7表明,刺果番荔枝葉多酚對羥自由基(·OH)具有較強的清除功效,隨著濃度增加,清除率逐漸升高最后趨于穩定,在試驗范圍內的最大清除率為52.50%±2.29%。將刺果番荔枝葉多酚及抗壞血酸的質量濃度與其對羥自由基(·OH)清除率進行線性擬合,都呈良好的量效關系,擬合方程分別為y=0.101x+24.882(R2=0.956)和y=0.054x+43.973(R2=0.916)。刺果番荔枝葉多酚的半抑制濃度(IC50)為264.65 μg/mL,大于抗壞血酸的半抑制濃度(IC50)81.82 μg/mL。在試驗濃度范圍內與同濃度抗壞血酸比較,刺果番荔枝葉多酚對羥自由基(·OH)的清除功效不及同濃度抗壞血酸。在質量濃度為300 μg/mL時,刺果番荔枝葉多酚、抗壞血酸對羥自由基(·OH)的清除率相當,分別為為52.50%±2.29%、57.83%±1.32%,表明刺果番荔枝葉多酚對羥基自由基有較強的清除功效。

圖7 不同質量濃度刺果番荔枝葉多酚對羥自由基(·OH)清除能力

3 結論

本試驗選用乙醇浸提法對刺果番荔枝葉多酚進行提取,通過Box-Benhnken中心組合試驗優化工藝參數。在最優提取工藝為乙醇體積分數55%、液料比50∶1 mL/g、提取時間96 min、提取溫度60 ℃,實際測得多酚提量為(20.37±0.34) mg/g,理論值相近,能為工業生產提供優化方案。在試驗濃度范圍內,提取刺果番荔枝葉得到的多酚類物質對DPPH和·OH的清除率較高,雖然刺果番荔枝葉多酚提取物清除功效雖不及同濃度抗壞血酸,但清除功效良好。因此,刺果番荔枝在抗氧化功能食品和藥品研發方面具備很好的潛力。