基于低共熔溶劑法超聲輔助蒸餾提取胡椒葉精油的工藝優化及其GC-MS分析

陳長鍇,樊志國,趙鳳翔,吳潁潁,施瑞城,*

(1.三沙南海美源島生物科技有限公司,海南三沙 573199;2.海南大學食品科學與工程學院,海南?？?570100)

胡椒(PipernigrumL.)是胡椒科胡椒屬多年生常綠開花藤本植物,是海南的一項特色農產品,占全國胡椒總產量的90%以上。在傳統醫學領域,胡椒是應用的非常廣泛的藥物[1]。泰國的當地人在市場購買胡椒的葉和莖用來治療某些疾病[2]。由于精油具有抗氧化[3]、抑菌[4]等活性,可用于食品的保鮮[5]和化妝品工業中[6]。此外精油的化學成分非常豐富,具有一定的保健功效,如抗炎[7]、活血化瘀等。

目前,對胡椒精油的研究主要集中在胡椒葉和胡椒果上。張水平等[8]采用水蒸氣蒸餾法提取胡椒葉精油,其精油得率為1.25%。杜麗君等[9]采用溶劑萃取法提取胡椒木葉片精油,其精油得率為0.405%。謝敏華[10]采用超臨界CO2萃取黑胡椒精油得率為7.02%。王穎等[11]采用超聲微波協同技術提取白胡椒精油,發現白胡椒果精油得率相對較高為3.80%。然而水蒸氣蒸餾法[12-13]、溶劑浸提法[14-15]、超臨界CO2萃取法[16]等傳統方法的成本效益高和過長的提取時間,因此,尋找一種成本低、提取時間短、綠色環保的提取方法很有必要。

Abbott等[17]發現了一種由一定摩爾比的氫鍵受體(hydrogen bond acceptor,HBA)(如季銨鹽)和氫鍵供體(hydrogen bond donor,HBD)(如羧酸、多元醇)組成的新型、綠色和低熔點的離子溶劑[18-20]。低共熔溶劑(deep eutectic solvents,DES)具有良好的熱穩定性和低揮發性,特別是具有易降解性、制備簡單、成本廉價等優點。本文以低共熔溶劑作為提取劑,采用超聲輔助水蒸氣蒸餾的方法提取胡椒葉精油,并用響應面法對胡椒葉精油提取工藝影響較大的三個因素即液料比、超聲功率和蒸餾時間進行優化,以便獲取最佳的提取條件,并采用氣相色譜-質譜法分析精油成分,以期為精油的提取方法提供一條新思路,拓展DES的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡椒葉 海南省定安縣黃竹鎮;正己烷 色譜純,購自美國Mreda公司;氯化膽堿、乙二醇、乳酸、尿素、葡萄糖、甘油、正己烷、無水硫酸鈉 均購自美國阿拉丁試劑有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

KH-1500DB型單槽式數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;DFY-200C高速萬能粉碎機 上海皓莊儀器有限公司;YHG-9050A臺式電熱恒溫鼓風干燥箱 上海姚氏儀器設備有限公司;AL-IC系列分析天平 上海精密儀器儀表有限公司;JB揮發油測定器 常州普天儀器制造有限公司;AMD10氣相色譜質譜聯用儀 常州磐諾儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 新鮮胡椒葉清洗干凈,在60 ℃的電熱鼓風干燥箱中烘干至恒定重量,粉碎并過篩(50目)置于干燥器中干燥備用。

根據文獻報道,制備DES、HBA(氯化膽堿)和HBD在80 ℃的恒溫水浴鍋中混合加熱攪拌0.5～2.0 h,直至形成均勻無色透明的液體。按照表1制備不同類型的DES。

表1 不同類型DES

1.2.2 胡椒葉精油提取工藝 準確稱取30 g的胡椒葉粉末,加入一定量的DES置于500 mL圓底燒瓶中,按液料比加入蒸餾水進行超聲輔助處理30 min,然后利用揮發油提取器水蒸氣蒸餾提取胡椒葉精油,分液之后加無水硫酸鈉干燥,稱量并計算胡椒葉精油得率。

胡椒葉精油得率(%)=(提取精油的重量/干胡椒葉粉末重量)×100

1.2.3 不同類型DES對精油得率的影響 按照表1所示,胡椒葉粉末經過DES-1、DES-2、DES-3、DES-4、DES-5進行提取,根據胡椒葉精油得率來分析5種DES對精油的提取效果,選擇提取效果最好的DES進行后續的單因素實驗。

1.2.4 單因素實驗 采用1.2.2的方法提取胡椒葉精油,提取條件為:保持超聲功率300 W、蒸餾時間50 min的因素不變,比較不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g)對胡椒葉精油得率的影響;保持液料比10∶1 mL/g,蒸餾時間50 min的因素不變,比較不同超聲功率(100、200、300、400、500 W)對胡椒葉精油得率的影響;保持液料比10∶1 mL/g,超聲功率300 W的因素不變,比較不同蒸餾時間(30、40、50、60、70 min)對胡椒葉精油得率的影響。根據單因素實驗來探究各因素變量對胡椒葉精油得率的影響。

1.2.5 BBD優化胡椒葉精油提取條件 由1.2.4單因素實驗的結果,以液料比(A)、超聲功率(B)、蒸餾時間(C)為自變量,以胡椒葉精油得率(Y)為響應值,根據BBD設計實驗原理,設計三因素三水平的響應面進行分析實驗與統計分析。試驗設計因素與水平如見表2所示。

表2 響應面設計實驗因素與水平

1.2.6 GC-MS分析胡椒葉精油成分 GC條件:BR-5 ms毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度為60 ℃,以1.5 ℃/min的速度升至185 ℃,保持1 min,然后以9 ℃/min的速度升至275 ℃,保持2 min;進樣量0.5 μL;壓力2.4 kPa,載氣為He,流速1 mL/min,分流比40∶1。

MS條件:EI電離源,能量70 eV;離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,接口溫度250 ℃,質量掃描范圍m/z 35～500。

1.3 數據處理

所有實驗重復3次。使用SPSS 16.0統計軟件對單因素實驗數據進行單因素方差統計分析與顯著性檢驗,Design-Expert響應面軟件對胡椒葉精油提取的相關因素數據進行分析與響應面優化,采用Origin 8.5軟件作響應面圖。

2 結果與分析

2.1 DES類型的篩選

根據圖1可以看出5種低共熔溶劑對精油得率的影響中,DES-4(氯化膽堿-尿素)對胡椒葉精油提取效果最佳,其精油得率為1.312%±0.018%。Kumar等[21]研究表明,一些DES可以溶解纖維素,用于植物組織的預處理能增強細胞內化合物的釋放。根據實驗結果可知,氫鍵供體為酰胺類的低共熔溶劑(DES-4)對精油的提取得率優于氫鍵供體為多元醇類(DES-1、DES-2)、羧酸類(DES-3、DES-5)的低共熔溶劑。季銨鹽類(氯化膽堿)低共熔溶劑對纖維素的溶解機理是季銨鹽陽離子與纖維素羥基上的氧原子發生反應從而形成新的氫鍵,這符合纖維素羥基基團上的氫、氧原子參與的電子接受和提供機理[22-23],乙酸根陰離子與己內酰胺的作用能為半纖維素的溶解提供更多活性位點,而季銨鹽與酰胺類物質間的氫鍵結構使纖維素由致密有序結構向毛糙無序結構轉變[24],對木質素有著較強的溶解能力。故選擇氯化膽堿-尿素(DES-4)低共熔溶劑進行后續實驗。

圖1 不同類型DES對精油得率的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 液料比對精油得率的影響 根據圖2可以分析出,胡椒葉精油得率在液料比10∶1 mL/g之前時是隨液料比的增加而提高,胡椒葉精油得率在液料比為10∶1 mL/g時達到最大值,之后胡椒葉精油得率隨液料比的增加而區域緩慢,稍有降低。原因是當液料比過小即胡椒葉粉末中蒸餾水過少時,由于蒸餾水不能充分滲入胡椒葉粉末中,導致精油不易溢出,也有可能蒸餾水過少致使胡椒葉粉末局部受熱而降低了胡椒葉精油得率;當液料比過大即胡椒葉粉末中蒸餾水過多時,由于少部分胡椒葉精油溶解在水中從而降低其得率,同時考慮時間成本和能耗[25-26]。所以,液料比應控制在10∶1 mL/g左右較為合適。

圖2 液料比對精油得率的影響

2.2.2 超聲功率對精油得率的影響 根據圖3可以分析出,胡椒葉精油得率在超聲功率為300 W之前時是隨著超聲功率的增加而隨之提高,這是由于超聲功率過低時,空化作用較弱,使得液體內局部的拉應力不夠,精油不易溢出,當超聲功率增大時,空化作用會隨超聲功率的增大而增強,加快分子擴散速度,致使精油的溢出,從而提高精油得率;胡椒葉精油得率在超聲功率為300 W之后，隨著超聲功率的增加而降低,原因在于超聲功率過大時,空化作用大幅度增強,減少了物料停留在超聲場中的時間,降低了水分向植物組織內滲透的幾率,這與李雪[27]在用超聲輔助提取紫蘇精油的研究結果類似。因此,超聲功率應控制在300 W左右較為合理。

圖3 超聲功率對精油得率的影響

2.2.3 蒸餾時間對精油得率的影響 根據圖4的可以分析得到,胡椒葉精油得率在蒸餾時間到達50 min之前時是隨蒸餾時間的增加而提高,這是由于蒸餾時間比較短,精油溢出不徹底,故精油得率不高;精油得率在蒸餾時間為50 min時達到最大值。但蒸餾時間超過50 min之后,胡椒葉精油得率反而有所降低,可能由于部分精油的揮發損失所致,在馬玉花等[28]研究杏仁精油提取工藝中有著類似的發現,同時考慮時間成本和能量的消耗,所以蒸餾時間應控制在50 min左右比較合適。

圖4 蒸餾時間對精油得率的影響

2.3 響應面法優化胡椒葉精油提取條件試驗結果

2.3.1 響應面優化實驗設計結果及方差分析 根據單因素實驗結果,把液料比(A)、超聲功率(B)、蒸餾時間(C)作為優化參數,以胡椒葉精油得率(Y)為響應值,根據BBD設計原理進行響應面分析,結果如表3所示。

表3 響應面實驗設計與結果

利用Design-Expert軟件對所得數據進行回歸分析與方差分析,由此可以得到Y(精油得率)與液料比(A)、超聲功率(B)、蒸餾時間(C)的二次回歸方程為:

Y=1.32+0.082A+0.13B+0.034C+0.012AB+0.044AC+0.036BC-0.07A2-0.17B2-0.12C2。

表4 回歸模型及方差分析

2.3.2 響應面圖分析 通過Design expert軟件對胡椒葉精油進行響應面方差分析以及回歸方程模型的建立,然后利用Origin8.0軟件做出相應的響應曲面圖,如圖5～圖7所示。

圖5 液料比和超聲功率對胡椒葉精油得率交互影響的響應面圖

由圖5～圖7可分析各因素對胡椒葉精油的率的影響以及各因素之間的相互作用,保持液料比(A)、超聲功率(B)、蒸餾時間(C)任意一個因素為零水平,另外兩個因素間的交互作用及對胡椒葉精油得率的影響。由圖5～圖7結果可知,從響應面的走勢及坡度來看,圖6～圖7曲面走勢陡峭,說明液料比和蒸餾時間、超聲功率和蒸餾時間之間交互效應較顯著,與方差分析結果一致。從等高線的形狀及疏密程度看,圖6～圖7等高線形狀都呈現橢圓形且曲線較密集,說明液料比和蒸餾時間、超聲功率和蒸餾時間之間互作效應較強,其互作效應對響應值的影響顯著。

圖6 液料比和蒸餾時間對胡椒葉精油得率交互影響的響應面圖

圖7 超聲功率和蒸餾時間對胡椒葉精油得率交互影響的響應面圖

2.4 最佳條件與驗證實驗

由Design expert軟件分析得到回歸方程,回歸模型預測提取胡椒葉精油的最佳優化條件為:液料比13.63∶1 mL/g,超聲功率344.11 W,蒸餾時間53.39 min,精油得率最大達到1.387%。鑒于工藝流程的可操作性和便利性,修正后的胡椒葉精油提取的工藝參數為:液料比14∶1 mL/g,超聲功率300 W,提取時間53 min。根據修正后的工藝參數,重復3次實驗來驗證胡椒葉提取精油得率,由此得到胡椒葉精油實際的得率為1.380%±0.018%,與響應面模型理論值相對誤差約為0.50%(誤差在允許范圍之內),說明實際情況與回歸模型預測情況擬合較好。利用響應面法對基于DES的超聲輔助水蒸氣蒸餾提取胡椒葉精油的優化工藝,其結果準確可靠。

利用DES來提取胡椒葉精油與傳統方法相比,精油的色澤、性狀等外觀沒有明顯區別,在常溫下為淡藍色透明的油狀液體,伴隨著濃厚的胡椒葉氣味。由表5可知,新方法跟水蒸氣蒸餾法和超聲輔助水蒸餾蒸餾法相比,胡椒葉精油得率分別提高了14.33%、5.18%。其結果跟張水平等[8]研究胡椒果與胡椒葉精油化學成分分析的結果相似,說明實驗結果符合預期。

表5 不同提取方法對精油得率的影響

2.5 胡椒葉精油GC-MS成分分析

從胡椒葉精油中共分離檢測到34種揮發性化學成分,利用質譜信息與標準譜庫NIST08分別對各色譜峰進行初步檢索及相關文獻參考定性,確認揮發性物質名稱,其分析結果見表6。由表6可知,其中烯烴類18個,醇類11個,醛類1個,酚類1個,酯類1個,其他化合物2個,主要成分包括:δ-欖香烯(19.75%)、α-蓽澄茄油烯(9.17%)、石竹烯(8.97%)、α-古蕓烯(6.12%)、β-欖香烯(5.13%),其中烯烴類化合物含量最為豐富,占精油成分73.0%。張水平等[8]的研究中胡椒葉精油的主要成分為δ-欖香烯,其含量占總物質成分的38.54%,而在本研究中δ-欖香烯的含量為19.75%,這可能是跟胡椒葉的品種類型、地理環境、處理方式以及提取條件等因素差異所導致。本實驗提取的胡椒葉精油中的δ-欖香烯的相對較高,根據相關的文獻記載所知,δ-欖香烯具有顯著的抗腫瘤作用[29],其中β-欖香烯屬于國家二類非細胞毒性腫瘤藥物,使胡椒葉具有很高的開發和利用價值。

表6 胡椒葉精油化學組成成分

3 結論

本研究利用新型的低共熔溶劑來提取胡椒葉精油,通過單因素實驗和響應面分析法優化了胡椒葉精油提取的工藝條件,以液料比、超聲功率和蒸餾時間為自因素,以胡椒葉精油得率為響應值進行胡椒葉精油的響應面回歸模型分析,修正提取胡椒葉精油工藝優化條件后為:液料比14∶1 mL/g、超聲功率300 W、提取時間53 min,由此得到胡椒葉精油實際得率為1.380%±0.018%,該回歸模型預測值與實際值吻合較好,進一步驗證了該模型的可靠性。通過基于DES超聲輔助水蒸氣蒸餾胡椒葉精油的工藝,精油得率比水蒸氣蒸餾精油得率提高了14.33%,比超聲輔助水蒸氣蒸餾精油得率提高了5.18%。由此說明,以氯化膽堿-尿素作為低共熔溶劑提取胡椒葉精油的方法是可行的。通過GC-MS分析鑒定出34種化合物,其主要成分為δ-欖香烯(19.75%)、α-蓽澄茄油烯(9.17%)、石竹烯(8.97%)、α-古蕓烯(6.12%)、β-欖香烯(5.13%),其中δ-欖香烯具有很好的研究價值。本文為胡椒葉精油的開發利用提供了一種新的提取方法,同時拓寬了DES應用領域。胡椒葉的綜合利用也有利于胡椒葉精油在食品、藥品及化妝品行業的普及。