豬小腸粘膜堿性磷酸酶的分離純化及性質(zhì)研究

楊 紅,謝智鑫,劉丹怡,劉容旭,楊宏博,韓建春,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省綠色食品研究院,黑龍江哈爾濱 150000)

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)是一類磷酸酯水解酶,能水解磷酸單酯生成磷酸根離子以及對(duì)應(yīng)的醇、酚等。ALP是具有兩個(gè)鋅離子和一個(gè)鎂離子的同型二聚體蛋白。細(xì)菌及人體中都發(fā)現(xiàn)了ALP,存在于眾多生物中,在生物體內(nèi)能夠維持鈣磷酸代謝平衡[1]。在多項(xiàng)研究表明下,ALP水平已被用作疾病診斷的指標(biāo);其血清中升高的水平與骨骼、肝臟和其他疾病的存在相關(guān)[2]。在基因工程中,ALP可以作為工具酶使用,因此對(duì)不同來(lái)源的ALP進(jìn)行分離、純化及其性質(zhì)研究具有重要意義[3]。

目前,國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者分別對(duì)不同種屬來(lái)源的ALP進(jìn)行分離、純化。在動(dòng)物體內(nèi)研究頗多,例如雞肝[4]、白鰱腸[5]、草魚肝胰臟[6]等,少數(shù)學(xué)者也對(duì)動(dòng)物肌肉組織中的ALP進(jìn)行過(guò)分離、純化。

雖然有大量學(xué)者對(duì)ALP進(jìn)行過(guò)分離純化,但總結(jié)目前常規(guī)純化動(dòng)物組織ALP的方法主要是利用正丁醇除脂、硫酸銨分級(jí)沉淀,然后采用陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾的方法達(dá)到分離、純化目的。例如余同等[7]也是通過(guò)正丁醇提取、硫酸銨作用下沉淀、經(jīng)過(guò)EAE-32柱層析、最后凝膠過(guò)濾得到純牛小腸的ALP;焉翠蔚等[8]用Tris-HCl緩沖液取代正丁醇提取、硫酸銨分級(jí)沉淀、柱層析、凝膠過(guò)濾等步驟從菲律賓蛤仔中分離純化得到ALP。除此之外,Wang等[9]從牛小腸中采用仿生染料配體固定在Sepharose CL-6B上的方法,用親和吸附劑與含有Cibacron Blue 3F-GA的非仿生吸附劑進(jìn)行分離純化ALP。近些年,國(guó)外的研究人員Farzi-Khajeh等[10-11]從蛋黃和脫脂牛乳中采用化學(xué)沉淀法和表面修飾等方法制備了堿性磷酸酶的專用納米載體,用納米載體方法快速、低成本的進(jìn)行分離純化ALP。

本文旨在探究以豬小腸粘膜為原材料的ALP分離、純化的新方法,利用蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性,通過(guò)疏水層析與離子交換層析相結(jié)合的方法對(duì)其進(jìn)行純化,對(duì)純化后的豬小腸粘膜ALP進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)分離、純化的基礎(chǔ)上增加疏水層析過(guò)程,改變蛋白質(zhì)的疏水性從而直接結(jié)合在層析填料上,從而代替正丁醇除脂、硫酸銨分離沉淀蛋白的方法,達(dá)到分離、純化豬小腸粘膜ALP的方法,為不同來(lái)源的ALP及蛋白質(zhì)分離純化提供新的方法,同時(shí)也為進(jìn)一步研究該酶和不同來(lái)源的ALP分離純化提供理論上的參考和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬小腸 來(lái)源于黑龍江省甜草崗黑豬肉直營(yíng)店,采用無(wú)菌薄膜包裝后冷凍(-20 ℃)儲(chǔ)存;BCA 蛋白定量試劑盒、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、TEMED(四甲基乙二胺)、過(guò)硫酸銨 Sigma公司;堿性磷酸酶試劑盒 Beyotime公司;DEAE BestaroseTMFF弱陰離子交換介質(zhì)、Phenyl BestaroseTMHP高分辨率疏水層析介質(zhì)、Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析介質(zhì) Bestchrom公司;蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 Solarbio公司;其他有機(jī)試劑 均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬小腸粘膜ALP的分離純化 參照余同等[7]方法并適當(dāng)修改,豬小腸經(jīng)過(guò)蒸餾水清洗后刮取內(nèi)壁黏膜,將其真空凍干(溫度:-35～-50 ℃、時(shí)間:24 h)成水分含量小于5%的小腸粘膜凍干粉。

取4 g凍干粉按照1∶200 (m/V)加入含有0.8 mol/L(NH4)2SO4、0.1%吐溫80的20 mmol/L Tris-HCl pH8.5的樣品緩沖液,勻漿后均勻攪拌1 h;4 ℃條件下10000 r/min,離心20 min,上清液濾過(guò)(0.45 μm濾膜),獲得豬小腸ALP粗酶液。將準(zhǔn)備好的粗酶液用AKTA pure 蛋白純化儀進(jìn)行純化。

首先采用疏水層析。在上樣前要平衡疏水層析柱,洗脫過(guò)程按直線梯度,洗脫緩沖液濃度為20 mmol/L Tris-HCl(pH8.5),其中含有0.8～0 mol/L(NH4)2SO4,收集每管5 mL洗脫峰用于檢測(cè)活性,合并活力峰后用20 mmol/L Tris-HCl pH8.5的緩沖液進(jìn)行脫鹽置換。然后將上一步所得液進(jìn)行DEAE陰離子層析,進(jìn)行直線梯度洗脫的洗脫過(guò)程同上,但將上述洗脫緩沖液(NH4)2SO4換成NaCl為 0～0.5 mol/L的濃度進(jìn)行,活性檢測(cè)同上述,合并活力峰超濾濃縮后過(guò)Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析得豬小腸ALP。

1.2.2 酶活力的檢測(cè) 采用堿性磷酸酶試劑盒[12-13]測(cè)定其酶活力,原理為酶在底物p-NPP(對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉)作用下呈現(xiàn)黃色產(chǎn)物,可在400～415 nm檢測(cè)吸光度。酶活力計(jì)算:在pH9.8的DEA緩沖液、37 ℃條件下,每分鐘水解p-NPP顯色底物所產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的堿性磷酸酶的量定義為一個(gè)酶活力,具體根據(jù)試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 采用Bradford法[14]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2.4 SDS-PAGE電泳 采用分離膠和濃縮膠體積分?jǐn)?shù)分別為10%、5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定,利用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

1.2.5 圓二色譜(CD)檢測(cè) 參考陳鳳娟[15]方法,對(duì)分離純化后的豬小腸粘膜ALP進(jìn)行圓二色譜檢測(cè)。

1.2.6 豬小腸ALP酶學(xué)特性研究

1.2.6.1 最適pH及其pH穩(wěn)定性的測(cè)定 緩沖液配制成濃度為20 mmol/L,不同pH的Tris-HCl(pH7.0～8.0)、Gly-NaOH(pH9.0～10.0)、NaHCO3-NaOH(pH11.0～12.0)。將不同pH的緩沖液取0.9 mL、加入0.1 mL的蛋白質(zhì)酶液混合,然后在37 ℃預(yù)熱5 min后檢測(cè)活性。在不同pH下,得到的酶活力繪制成曲線,求出豬小腸ALP的最適pH。室溫下,測(cè)定穩(wěn)定性時(shí),將酶液于不同pH下靜置1 h后測(cè)定其酶活。酶活測(cè)定方法同1.2.2。

相對(duì)酶活(%)=測(cè)定pH的酶活/最適pH的酶活×100

1.2.6.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 采用pH9.5的樣品緩沖液(Gly-NaOH),溫度分別設(shè)定為從10、20～60 ℃(每間隔5 ℃),共10個(gè)溫度值。保溫時(shí)間10 min,測(cè)定酶活力。測(cè)定穩(wěn)定性時(shí),將測(cè)的酶液放在不同溫度下保溫1 h后測(cè)定其酶活,酶活測(cè)定方法同1.2.2。

相對(duì)酶活(%)=測(cè)定溫度的酶活/最適溫度的酶活×100

1.2.6.3 金屬離子及EDTA對(duì)酶活的影響 取等量酶液分別加入MgCl2、ZnCl2、CaCl2、EDTA及蒸餾水,使其最終濃度1、5、25、50 mmol/L,在最適溫度和pH下,37 ℃預(yù)熱10 min,檢測(cè)酶活。

相對(duì)酶活(%)=加入金屬離子的酶活力/未加入金屬離子的酶活力×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,Origin 8.0軟件及CDPro軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小腸粘膜ALP的分離純化

2.1.1 Phenyl High Performance疏水層析 制備豬小腸粘膜粗酶液完成后,首先對(duì)其進(jìn)行疏水層析。將疏水層析柱裝好后,用含有0.8 mol/L(NH4)2SO4、20 mmol/L Tris-HCl pH8.5的緩沖液平衡4～5個(gè)柱體積,使疏水填料達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài);然后以5 mL/min的流速進(jìn)行上樣,完成后再用上述緩沖液進(jìn)行再平衡達(dá)到穩(wěn)定。疏水層析圖及酶活力如圖1所示。

圖1 ALP的Phenyl High Performance疏水層析圖

由圖1可知,當(dāng)(NH4)2SO4濃度由0.8 mol/L逐漸降低到0 mol/L時(shí),疏水層析過(guò)程中主要出現(xiàn)4個(gè)洗脫峰,其中峰1主要集中在1～34管區(qū)域,峰2主要集中在35～45管區(qū)域,峰3集中在46～55管區(qū)域,峰4集中在56～65管區(qū)域。當(dāng)(NH4)2SO4濃度由0.8 mol/L降低到0.4 mol/L時(shí),根據(jù)酶活力的測(cè)定結(jié)果可知,小腸粘膜ALP被大量洗脫下來(lái);當(dāng)(NH4)2SO4的濃度小于0.4 mol/L后,出現(xiàn)三個(gè)洗脫峰,但是根據(jù)酶活力測(cè)定結(jié)果顯示,在35～45管區(qū)域酶活力逐漸降低,46～65管區(qū)域雖然有活力,但是蛋白質(zhì)含量逐漸升高,說(shuō)明此區(qū)域有大量雜質(zhì)蛋白被洗脫,故將35～65管區(qū)域中的洗脫液舍去,1～34管合并為一管,用20 mmol/L Tris-HCl pH8.5的緩沖液進(jìn)行脫鹽置換。經(jīng)過(guò)過(guò)濾(0.2 μm濾膜)后冷藏保存待用。

2.1.2 DEAE Fast Flow陰離子層析 2.1.1所得洗脫液進(jìn)行DEAE弱陰離子層析。首先用20 mmol/L Tris-HCl pH8.5的緩沖液進(jìn)行平衡后上樣,待上樣完成后用相同的緩沖液進(jìn)行再平衡,待達(dá)到平衡后進(jìn)行洗脫。

洗脫緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫,洗脫速度為5 mL/min,洗脫液收集為5 mL每管,用于檢測(cè)活性,結(jié)果如圖2所示。

圖2 ALP的DEAE Fast Flow陰離子層析圖

由圖2可知,當(dāng)NaCl濃度由0 mol/L逐漸升高到0.5 mol/L時(shí),DEAE陰離子交換層析過(guò)程中主要出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰,其中峰1主要集中在1～12管區(qū)域,峰2主要集中在13～21管區(qū)域,峰3集中在22～35管區(qū)域。根據(jù)酶活力測(cè)定結(jié)果可知,峰1為主要的活力峰,峰2、3區(qū)域雖有活性但酶活迅速降低,與此同時(shí)其他的雜質(zhì)蛋白被大量洗脫下來(lái),故將13～35管舍去,留下1～12管。

2.1.3 Sephacry S-200凝膠過(guò)濾層析 將2.1.2所得到洗脫液經(jīng)過(guò)濃縮后過(guò)S-200凝膠層析,洗脫液為20 mmol/L Tris-HCl pH8.5,洗脫速度為1 mL/min,以每管1 mL收集洗脫峰并檢測(cè)活性,Sephacry S-200凝膠過(guò)濾層析結(jié)果如圖3所示。

圖3 ALP的Sephacry S-200凝膠層析圖

由圖3可知,經(jīng)Sephacry S-200凝膠過(guò)濾層析后得到1個(gè)洗脫峰。根據(jù)酶活力測(cè)定結(jié)果可知,隨著蛋白濃度的升高酶活力增強(qiáng),并且洗脫峰有良好的對(duì)稱性,說(shuō)明可能是一類蛋白被洗脫下來(lái)。可以通過(guò)SDS-PAGE電泳圖對(duì)其純度進(jìn)行測(cè)定。

2.1.4 豬小腸ALP分離純化小結(jié) 豬小腸粘膜經(jīng)過(guò)真空凍干、緩沖溶液充分溶解、離心等步驟處理后,先后經(jīng)過(guò)Phenyl High Performance疏水層析,DEAE Fast Flow陰離子層析,Sephacryl S-200凝膠層析純化后得到豬小腸粘膜ALP,分別留樣測(cè)定蛋白濃度和活性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 豬小腸粘膜中ALP的分離純化

由表1可知,豬小腸粘膜粗酶凍干粉(經(jīng)正丁醇處理)經(jīng)過(guò)Tris-HCl溶解后,利用Phenyl High Performance疏水層析介質(zhì)對(duì)其進(jìn)行純化,堿性磷酸酶的比活力由0.28 U/mg升至為7.9 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)到28.2,酶活損失約為68.5%,剩余酶活約為31.5%。表明原料中約有30%甚至更高的堿性磷酸酶可以與Phenyl High Performance疏水層析介質(zhì)發(fā)生結(jié)合,說(shuō)明Phenyl High Performance疏水層析介質(zhì)可以利用堿性磷酸酶的蛋白質(zhì)疏水性對(duì)其進(jìn)行分離純化。經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾的堿性磷酸酶比活力達(dá)到19.1 U/mg,純化倍數(shù)68.2。純化倍數(shù)低于牛肝[16]獲得的ALP的純化倍數(shù)(228.74),高于從海參腸[17]中獲得的ALP的純化倍數(shù)(10.93)和合浦珠母貝[18]的純化倍數(shù)(48.56)。

2.2 SDS-PAGE 電泳圖

取純化好的豬小腸ALP(已完成凝膠過(guò)濾層析),通過(guò)SDS-PAGE電泳得到的電泳圖如圖4所示。

圖4 ALP的SDS-PAGE電泳圖

圖4中,能夠清晰看到單獨(dú)一條帶為純化后的ALP,已達(dá)到電泳純,根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)第一列的分子量Maker,得到純化后的樣品分子量為57.0 kDa。與馬金虎等[6]從草魚肝胰臟ALP中分離得出的分子量約為54 kDa相近。而不同種屬來(lái)源的ALP的分子量大小也不盡形同,大涼疣螈[19]為48.1 kDa,乳酸菌[20]為40 kDa,墨吉明對(duì)蝦[21]為70 kDa,羅氏沼蝦[22]為72 kDa。

2.3 圓二色譜(CD)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的分析

本實(shí)驗(yàn)采用200～260 nm遠(yuǎn)紫外光譜下測(cè)定經(jīng)分離純化后的堿性磷酸酶樣品,測(cè)定結(jié)果如圖5所示。

圖5 ALP的圓二色譜圖譜

表2 ALP二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

根據(jù)Origin 8.0軟件及CDPro軟件包分析進(jìn)行圖譜分析,分離純化后的豬小腸粘膜ALP的蛋白質(zhì)溶液中,α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲分別為3.6%、41.8%、21.5%、33.1%。

2.4 小腸粘膜ALP的酶學(xué)特性

2.4.1 ALP的最適pH及其穩(wěn)定性 采用1.2.2方法測(cè)定pH對(duì)ALP相對(duì)酶活力的影響見(jiàn)圖6,豬小腸粘膜ALP在pH7.0～8.5時(shí)相對(duì)酶活力較低,隨著pH增加相對(duì)酶活力逐漸升高,當(dāng)pH9.5時(shí)ALP相對(duì)酶活力達(dá)到最高,當(dāng)pH大于9.5時(shí),相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)。豬小腸ALP最適pH為9.5,與牛小腸[7]、豬肌肉組織[23]、合浦珠母貝[18]以及菲律賓蛤仔[8]接近,與其他ALP來(lái)源,例如南方鲇[24]10.1、白鰱腸[5]10.2、黃鱔肝臟[25]10.4、雞肝[4]10.5均有不同程度的差異性,由此說(shuō)明不同物種來(lái)源的ALP的性質(zhì)也不盡相同。

圖6 pH對(duì)ALP活力及其穩(wěn)定性的影響

pH對(duì)ALP穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖6,豬小腸粘膜ALP在pH7.0～10.5時(shí)相對(duì)酶活力較為穩(wěn)定,在pH超過(guò)10.5后相對(duì)酶活迅速下降,由此可以猜測(cè)當(dāng)pH大于10.5時(shí),ALP的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致酶活力迅速下降。

2.4.2 ALP最適溫度及其穩(wěn)定性 溫度對(duì)ALP相對(duì)酶活力的影響,見(jiàn)圖7,溫度在10～30 ℃之間相對(duì)酶活力逐漸上升時(shí),高于30 ℃時(shí),隨著溫度升高相對(duì)酶活力逐漸減少,由此說(shuō)明豬小腸粘膜ALP在30 ℃時(shí)相對(duì)酶活力最高。牛小腸[7]和海參腸[17]中的為45 ℃、地衣芽孢桿菌[26]為50 ℃,由此可見(jiàn)差異性。

圖7 溫度對(duì)ALP酶活力及其穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)ALP穩(wěn)定性的影響如圖7,在40 ℃前相對(duì)酶活力隨著溫度升高能夠保持平穩(wěn),在此之后隨著溫度變化相對(duì)酶活力逐漸減少,由此說(shuō)明當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí),ALP相對(duì)酶活力穩(wěn)定性差且迅速降低。

2.4.3 金屬離子及EDTA對(duì)ALP酶活力的影響 金屬離子對(duì)ALP酶活力有影響,是源于ALP作為金屬酶。測(cè)定豬小腸ALP活性受不同濃度的金屬離子的影響,結(jié)果如表3所示。

表3 常見(jiàn)金屬離子對(duì)酶活力的影響(%)

Mg2+、Zn2+、Ca2+以及EDTA對(duì)豬小腸粘膜ALP的酶活力均有一定程度的影響,其中起到豬小腸ALP激活作用的為Mg2+、Ca2+,抑制作用的為Zn2+、EDTA。起到激活作用的濃度在低濃度(1 mmol/L)時(shí),Mg2+和Ca2+有不同的激活效果,Ca2+比Mg2+的作用強(qiáng),隨著濃度升高M(jìn)g2+和Ca2+對(duì)豬小腸ALP的激活能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)濃度大于25 mmol/L時(shí),Mg2+和Ca2+對(duì)ALP酶活力的影響相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)Zn2+濃度在1～5 mmol/L時(shí),豬小腸ALP的酶活力呈下降趨勢(shì)明顯,對(duì)其影響相對(duì)穩(wěn)定時(shí)的濃度大于5 mmol/L。在金屬離子Zn2+的影響下,隨著濃度的增加使得ALP的蛋白質(zhì)變形失活,可能由于Zn2+本身結(jié)合力使其占據(jù)底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)。EDTA作為金屬螯合劑對(duì)ALP酶活力有較強(qiáng)的抑制作用,隨著濃度的增加ALP酶活力逐漸降低,因此可知ALP作為一種金屬酶,會(huì)受到金屬離子影響自身的結(jié)構(gòu)和活性[27]。ALP作為一種生物體物質(zhì)代謝的糖蛋白,研究金屬離子和EDTA對(duì)酶活性的影響是有必要的,可以通過(guò)合適的金屬離子來(lái)改善豬小腸粘膜的ALP酶活性,有助于提高經(jīng)濟(jì)效益,為將來(lái)繼續(xù)進(jìn)一步探究金屬離子對(duì)豬小腸ALP酶活性提供方法。

3 結(jié)論

豬小腸粘膜經(jīng)過(guò)分離純化得到的豬小腸粘膜ALP,該酶達(dá)到電泳純,分子量為57.0 kDa,純化倍數(shù)為68.2,比活力倍數(shù)為19.1 U/mg。利用圓二色性光譜測(cè)定純化后蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果為α-螺旋3.6%、β-折疊41.8%、β-轉(zhuǎn)角21.5%、無(wú)規(guī)則卷曲33.1%。ALP在催化底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)作用下最佳溫度30 ℃、最佳pH為9.5;金屬離子對(duì)ALP起到激活的離子為Mg2+和Ca2+，起到抑制的離子為Zn2+和EDTA。