李 陽,張 倩,楊 埔,柳青山,張一中,張麗珍,*

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.山西省農業(yè)科學院高粱研究所,山西晉中 030600)

醋是日常生活中一種常見的調味品,隨著釀醋工藝的發(fā)展和對醋功能的深入研究,食醋除了可以增添滋味、提供人體所必須的氨基酸外,還含有豐富的多酚[1]、黃酮[2]等物質,在抗癌[3]、心血管疾病[4]的預防方面也有很大作用。一般食醋的釀造過程主要是將糧食蒸煮后,加入發(fā)酵劑進行發(fā)酵[5],生料醋與傳統發(fā)酵最大的區(qū)別就是原料不需要蒸煮[6],直接進行發(fā)酵,微生物種類更多[7],因此口感更加醇厚柔和[8]。風味口感是判斷食醋質量的主要指標,對于生料醋而言,有機酸是其酸味的主要來源[9],是影響生料醋質量的重要因素。

目前多數的研究集中于山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋的菌群多樣性分析[10-11]、成分含量檢測[12-13],結果表明醋醅中乳桿菌屬(Lactobacillus)和醋桿菌屬(Acetobacter)占有較大組成,醋酸菌中巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)是發(fā)酵的關鍵菌株;也有學者[14]研究了固態(tài)釀造食醋中有機酸的種類,發(fā)現其中的有機酸除了乙酸外還有乳酸、琥珀酸。王興華等[15]檢測了老陳醋中醋酸和乳酸的含量,分別為1.51、1.2 (g/100 mL),對于生料醋的研究則局限于探討其發(fā)展前景[16]、分析其生產工藝[17],相比之下,生料醋中有機酸種類與含量的分析存在很大空白。為了更加深入的了解生料醋產酸菌的發(fā)酵特性,本試驗對生料醋中的菌株進行篩選、分離純化及鑒定,篩出產酸菌種,研究其生長情況,并分析其有機酸的種類與含量,對于生料醋品質的把控有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生料醋醅 于山西長治某生料醋廠采集,當日置于車載冰箱運回實驗室,-80 ℃超低溫冰箱保藏備用;無水葡萄糖 山東西亞化學工業(yè)有限公司;硫酸鎂 天津市北辰方正試劑廠;酵母浸粉,蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司;瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇(分析純) 天津歐博凱化工有限公司;磷酸二氫鉀(色譜純) 北京精求化工廠;乳酸,乙酸,琥珀酸,檸檬酸,草酸(純度>99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

AD-88大容量全溫氣浴振蕩器常 州國宇儀器制造有限公司;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;Agilent 1260Infinity II液相色譜儀 費爾伯恩精密儀器(上海)有限公司;ME204電子天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;BD-30自動菌落計數器 北京啟航博達科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 分離純化培養(yǎng)基:酵母粉3 g,蛋白胨4 g,葡萄糖10 g,瓊脂12 g,4000 μL 1.6%溴甲酚紫,水1000 mL,調節(jié)pH至6.0～6.2,在0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌27 min;

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,酵母粉10 g,硫酸鎂0.5 g,磷酸二氫鉀0.5 g,瓊脂12 g,水1000 mL,滅菌后加入4%無水乙醇,于0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌27 min。

1.2.2 產酸菌的分離純化 分別從發(fā)酵了12、18、24、30、36 d的醋醅中采樣約10 g,加入裝有50 mL蒸餾水的錐形瓶中,于28 ℃全溫氣浴振蕩器振蕩培養(yǎng)30 min,設置3個重復;將樣品稀釋1000倍后,吸取50 μL涂布至分離純化培養(yǎng)基,以溴甲酚紫為指示劑。菌落長出后,根據菌落周圍是否變成黃色來判斷是否產酸;挑取單個生長的產酸菌落,多次分離純化,直至長出單一菌落,最后挑取菌落在液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后,加入到甘油培養(yǎng)基中于-20 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 產酸菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學鑒定 挑取純化的菌株到滴有無菌水的潔凈載玻片上,將菌均勻涂抹自然干燥后,用草酸銨結晶紫染液染色約1 min,用水沖洗、干燥,進行光學顯微鏡觀察。

1.2.3.2 生物學鑒定 采用CTAB法[18-20]提取產酸菌總DNA,16S rDNA的基因擴增參照文獻[21-22]。

在1%的瓊脂糖凝膠上對PCR擴增產物進行電泳,若形成清晰條帶,則將擴增產物委托金唯智生物技術公司進行測序。在NCBI數據庫中進行BLAST序列比對,找到與目標菌株同源性較高的模式菌株后,利用MEGA6.0進行序列分析并構建系統發(fā)育樹。

1.2.4 優(yōu)勢產酸菌篩選

1.2.4.1 溫度耐受性 共設置五個溫度梯度,分別是28、37、42、47、52 ℃。將篩選出的菌種接種到分離純化培養(yǎng)基上,全部置于28 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)3～5 d后,菌落長出且培養(yǎng)基顏色變黃再轉接新的培養(yǎng)基平板置于37 ℃的培養(yǎng)箱中,照此方法重復42、47、52 ℃,每種溫度培養(yǎng)3 d左右觀察菌株長出與否以及培養(yǎng)基是否變黃色。

1.2.4.2 過氧化情況 在篩選產酸菌的過程中,有的菌種會出現過氧化的現象。在固體培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫,培養(yǎng)基變成黃色,說明該菌可以產酸,培養(yǎng)基再由黃色變成紫色,說明該菌可以分解乙酸,有過氧化乙酸的能力。接菌后28 ℃培養(yǎng)3～5 d,待菌株長出每天觀察培養(yǎng)基的顏色變化情況,以培養(yǎng)基能否變成紫色判斷該菌是否可以過氧化乙酸。

1.2.5 優(yōu)勢產酸菌巴氏醋桿菌L4特性研究

1.2.5.1 生長曲線的測定 將篩選出的巴氏醋桿菌接種至液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基活化兩次,于28 ℃、180 r/min的全溫氣浴振蕩器中過夜振蕩培養(yǎng),按2%接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,設置3個重復,置于振蕩器中培養(yǎng)至132 h,從0 h開始,每隔4 h采一次樣,采至36 h,再每8 h采樣一次,至84 h,后間隔12 h采樣一次,至132 h;將樣品分別稀釋到10-4、10-5,各吸取50 μL均勻涂布至培養(yǎng)基平板,于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),長出菌落后計數。

1.2.5.2 產酸特性 將接種了2%種子培養(yǎng)液的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基置于28 ℃、180 r/min的全溫氣浴振蕩器中培養(yǎng)至116 h,設置3個重復,從0 h開始采樣,每隔8 h采樣一次至80 h,后間隔12 h采樣一次至116 h,將樣品用0.45 μm濾膜過濾后通過高效液相色譜儀測定產酸類型和產酸量。

1.2.6 有機酸的檢測 產酸高效液相色譜檢測條件參照楊鈺昆等的測定方法[23]。色譜柱:Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀體積比為3∶97,磷酸調pH至2.7;流速:1.00 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:210 nm;進樣量:10 μL。

有機酸混標液:分別稱取草酸、乳酸、乙酸各0.01 g,檸檬酸、琥珀酸各0.02 g,定容至10 mL,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ圆煌倪M樣質量濃度為橫坐標,對應的不同峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程和相關系數。

1.3 數據統計

實驗數據均重復3次,由Excel 2003軟件計算制作圖表和SPSS 20軟件分析。

2 結果與分析

2.1 產酸菌的分離純化

添加有溴甲酚紫的培養(yǎng)基平板在酸性條件下會變成黃色,顏色變化明顯,因此溴甲酚紫可用作產酸指示劑,該方法于1992正式建立[24]。此法簡單易操作,便于產酸菌的初步篩選。

將生料醋醅的菌懸液稀釋涂布,于28 ℃培養(yǎng)2～3 d后,菌株產酸使平板變成黃色,如圖1所示。挑選出5株黃色明顯,形態(tài)完整的單菌落進行下一步研究,并編號為L1、L3、L4、L7、L11。

圖1 溴甲酚紫顯色平板上的產酸菌菌落形態(tài)

2.2 產酸菌的鑒定結果

菌株在分離純化培養(yǎng)基上的形態(tài)及顯微鏡觀察結果如圖2所示,菌落形態(tài)為圓形、中部隆起、顏色為乳白色、邊緣呈鈍齒或彌漫狀、表面光滑,經革蘭氏染色后,光學顯微鏡下觀察到短棒狀的菌體,單個或多個排列。

圖2 菌落形態(tài)圖和顯微觀察圖(100×)

平板初篩結果及菌株形態(tài)觀察不能準確將菌株鑒定到種,需結合分子生物學鑒定。

將L1、L3、L4、L7、L11等5株產酸菌的16S rDNA擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳,如圖3所示。5株產酸菌的PCR擴增基因大小約為1500 bp,條帶清晰,可進行下一步測序。

圖3 產酸菌16S rDNA的擴增產物電泳圖

利用NCBI數據庫進行BLAST比對,測得的DNA序列與巴氏醋桿菌相似度非常高,達到了97%以上。16S rDNA序列的相似度超過97%可確定為同一屬[25]。利用MEGA6.0構建Neighbor Joining系統進化樹,結果如圖4,可知5株產酸菌均屬同一種。綜合形態(tài)學鑒定產酸定性結果,可確定所得5株菌株為巴氏醋桿菌Acetobacterpasteurianus。

圖4 產酸菌的系統發(fā)育樹

2.3 優(yōu)勢產酸菌的篩選結果

2.3.1 溫度的耐受性結果 共設置28、37、42、47、52 ℃五個溫度梯度,根據有無菌落長出且培養(yǎng)基顏色是否變黃為判斷,5個單菌落對不同溫度的耐受性結果見表1。

表1 菌株對不同溫度的耐受性情況

由表1可知,五株產酸菌在28、37 ℃均可正常生長,L3在42 ℃時已不能存活,L1、L4、L7、L11在47 ℃高溫均長勢良好,L4對溫度的耐受性最好,在52 ℃仍可生長,且L4的產酸速度較快。

2.3.2 產酸菌的過氧化特性結果 將5個單菌落培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)時間延長到14 d,菌株出現的過氧化乙酸會使黃色的培養(yǎng)基變成紫色,5個菌株的過氧化情況有所不同,結果如表2所示。

由表2可知,L1、L3、L7、L11在發(fā)酵過程中均有不同程度的過氧化乙酸,其中L1、L3過氧化較少且慢,L7、L11過氧化較多且快,L4在發(fā)酵過程中沒有過氧化情況的出現。

表2 菌株的過氧化乙酸情況

綜合5株巴氏醋桿菌對溫度的耐受性及過氧化情況,挑選出產酸最快,耐52 ℃高溫,無過氧化的L4號菌株進行下一步發(fā)酵特性研究。

2.4 優(yōu)勢產酸菌巴氏醋桿菌L4特性研究

2.4.1 巴氏醋桿菌L4的生長曲線 由巴氏醋桿菌菌落數變化曲線(圖5)可知,在0～4 h之間菌落處于延滯期,因代謝系統適應新環(huán)境的需要,菌落數目沒有增加,8～12 h菌落數呈指數增長;12～16 h菌落數趨于穩(wěn)定;16 h菌落數達到了最大值為2.0×108CFU/mL,在巴氏醋桿菌培養(yǎng)生長初期培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富,因而菌株繁殖快;16 h后巴氏醋桿菌進入衰亡期,在20～132 h菌落個數沒有太大的波動,可能是由于菌落個數保持一段高密度生長后所需要的營養(yǎng)物質消耗高,不能維持下去而導致一些菌落淘汰。

圖5 巴氏醋桿菌菌落數變化曲線

2.4.2 HPLC測酸方法的確定 按照1.2.6所述方法對五種標準有機酸進行線性回歸分析(表3),結果表明所得標準曲線的相關系數均大于0.998,表明線性關系良好,該方法可以用于5種有機酸的測定。

表3 有機酸的回歸方程、相關系數、線性范圍及最低檢出限

五種有機酸標準品色譜圖如圖6所示:

圖6 有機酸混合標準溶液色譜圖

由圖7可知,生料醋醅在發(fā)酵過程中除了生成草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸五種有機酸外,還有幾種含量較高的有機酸,對其余有機酸的定性和定量檢測將是后續(xù)研究的重點。朱其瀚[26]從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選出一株巴氏醋桿菌,經測定可產乳酸、乙酸、酒石酸三種有機酸,相比之下生料醋中有機酸的種類更豐富,因此口感更為獨特。

圖7 L4發(fā)酵液有機酸色譜圖

2.5 有機酸的檢測

2.5.1 巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中乙酸含量的變化 分析圖8可得發(fā)酵過程中乙酸質量濃度的變化情況,巴氏醋桿菌在0～64 h發(fā)酵過程中乙酸含量略有波動但差異不顯著,維持在0.7 mg/mL左右,72～116 h乙酸質量濃度逐漸增加,72 h增速極顯著(P<0.01),可能是一部分乙醇被醋酸菌轉化為了乙酸,116 h乙酸質量濃度顯著增加且達到發(fā)酵過程中的最大值為1.8 mg/mL,低于鎮(zhèn)江香醋中乙酸的含量(4.95 mg/mL)[27],原因可能是單獨一株菌發(fā)酵與醋醅發(fā)酵微生物壞境有差距,造成乙酸含量低。

圖8 乙酸質量濃度變化

2.5.2 巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中乳酸含量的變化 由圖9可得,巴氏醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)前期乳酸質量濃度為0.6 mg/mL,在8～64 h之間乳酸含量緩慢增加,72 h時極顯著增加(P<0.01),達到了1.8 mg/mL,在116 h乳酸含量達到最大為2.1 mg/mL。可能由于EMP途徑將丙酮酸還原成乳酸[28],乳酸含量呈增加趨勢。生料醋中乳酸含量高于乙酸,乳酸作為不揮發(fā)酸賦予了食醋柔和的口感,可能也是生料醋口感更加綿柔的原因。

圖9 乳酸質量濃度變化

2.5.3 巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中草酸含量的變化 由圖10可知,草酸的質量濃度在整個發(fā)酵過程中差異顯著,在0.4～1.23 mg/100 mL之間波動。0～72 h逐漸上升并在72 h達到最高為1.23 mg/100 mL,80～116 h草酸含量略有波動。

圖10 草酸質量濃度的變化

2.5.4 巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中檸檬酸含量的變化 食醋中檸檬酸主要起調和口感的作用[29],由圖11可知巴氏醋桿菌的發(fā)酵過程中含量緩慢增加,維持在0.08～0.11 mg/mL之間,104 h含量最高,達到最大為0.11 mg/mL。

圖11 檸檬酸質量濃度變化

2.5.5 巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中琥珀酸含量的變化 琥珀酸作為醋中一種調味的有機酸,可中和乙酸引起的苦澀感,增加食醋的香醇味。由圖12可知,琥珀酸在整個發(fā)酵過程中質量濃度呈波浪型變化,0～32 h琥珀酸含量逐漸增加且增速顯著(P<0.05),32～80 h略有波動,104 h琥珀酸含量顯著(P<0.05)下降,可能是發(fā)酵過程中酸的含量增加,pH降低抑制了一些微生物的生長,影響了琥珀酸的含量,在發(fā)酵后期116 h琥珀酸含量達到平衡，為0.31 mg/mL。

圖12 琥珀酸質量濃度變化

3 結論

本試驗從生料醋醅中分離純化出巴氏醋桿菌,在16 h菌落數達到最大為2.0×108CFU/mL,20 h后醋桿菌進入了衰亡期。發(fā)酵前期主要是厭氧發(fā)酵,因此醋酸桿菌能將糖氧化產生乳酸,成為發(fā)酵過程中的主要有機酸,乳酸、乙酸作為醋中主要的揮發(fā)酸,含量變化顯著(P<0.05)。巴氏醋桿菌發(fā)酵過程中乳酸含量在92 h略有下降可能是作為碳源被利用的原因[30]。發(fā)酵過程中產量最高的有機酸為乳酸,草酸含量最低。檸檬酸在整個發(fā)酵過程中含量沒有明顯變化,琥珀酸是除乳酸外含量最豐富的特征性有機酸。