利用Illumina高通量測序技術篩選低溫降解玉米秸稈真菌

徐麗萍,姜 喆,葛英亮,王 鑫,倪 燕

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076;2.海南熱帶海洋學院食品科學與工程學院,海南三亞572022;3.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;4.黑龍江省綠色食品科學研究院,黑龍江哈爾濱 150028;5.國家大豆工程技術研究中心,黑龍江哈爾濱 150028)

纖維素物質是人類所需的最豐富的可持續利用資源,是植物界最豐富的天然高分子化合物和土壤中主要的有機碳組分[1-2]。自Pringsheim等1912年首次從土壤中分離出纖維素分解菌以來,人們相繼開展了對農作物秸稈纖維素降解方面的研究,而我國北方每年都產生大量玉米秸稈且因氣溫較低導致纖維素降解受到抑制[3]。

自然條件下,秸稈內纖維素的降解是一個復雜過程,需要微生物產生的多種纖維素酶參與[4]。自然界中也存在著各類真菌、細菌和放線菌等纖維素降解菌,其中,細菌所產生的纖維素酶酶系單一、酶的分離提取也比較困難;篩選放線菌難度較大、產量較低,所以研究較少[5]。而真菌因其具有較高的胞外酶活和胞內酶活且酶種類比較全面,使其具有很強的纖維素降解能力,成為降解纖維素的主要菌類之一[6-8]。目前,對于纖維素降解真菌的研究主要集中在中溫菌及常溫菌,對于低溫降解真菌的研究較少,低溫條件進行篩選具有高效、環保、成本低等優點[9-11]。且根際是植物、土壤、微生物之間進行物質和能量交換的關鍵區域,所以對玉米秸稈及根部土壤真菌菌群的研究及低溫降解菌的篩選,可為解決中溫帶及寒溫帶產區過剩秸稈因冬季氣溫較低且持續時間長難以降解利用提供幫助[12-14]。

高通量測序方法相較于傳統的純培養技術更能深入挖掘微生物群落的結構,從而為分析微生物的降解代謝提供理論依據。在本實驗研究中,采用高通量測序方法對玉米秸稈及秸稈根部土壤上附著的真菌群落進行分析,并在低溫下以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為唯一碳源,對玉米秸稈表面和根際土壤中可耐低溫、且可以大量生產的纖維素酶的真菌進行分離、純化,在不同溫度下測定平板水解圈大小,結合液態發酵測其失重率進行復篩,將理想菌株進行鑒定,以期篩選出簡單、高效且耐低溫的秸稈降解菌,對解決中溫帶及寒溫帶地區過剩的玉米秸稈降解有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米秸稈根部附著土壤及玉米根部秸稈 采集于秋季中國北部黑龍江省綏化地區的田間,標記為A、B,-20 ℃低溫保存。該地區年平均溫度為2.8 ℃左右,地處中溫帶,每年3～5月與8～10月即農耕前與秋收后氣溫的平均氣溫均處于0～15 ℃,因此,篩選真菌降解菌的溫度選為15 ℃;FastDNA Spin Kit For Soil 北京智杰方遠科技有限公司;Biospin Fungus Genomic DNA 北京博邁斯生物科技有限公司;QuickClean II PCR抽提試劑盒 南京金斯瑞生物科技有限公司;TransStart FastPfu DNA Polymerase 北京全式金微生物技術有限公司;TruSeqTMDNA Sample Prep Kit 美國Illumina公司。

SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;Scan300全自動菌落計數儀 法國Interscience公司;DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;HS-IE數顯振蕩培養箱 上海和盛儀器科技有限公司;JJ224BC分析天平 常熟市雙杰測試儀器廠;GeneAmp9700 PCR儀 美國應用生物系統(ABI)公司;DYCZ-24K/S型雙板垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司;Miseq PE300二代高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及ITS測序 按照試劑盒說明,分別提取樣品中基因組DNA,利用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)-ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對提取的基因組DNA進行PCR擴增。擴增條件為:95 ℃反應5 min;95 ℃、40 s,58 ℃、40 s,72 ℃、60 s循環30次;72 ℃延伸5 min,4 ℃終止反應[15]。擴增完成后,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測各樣品擴增產物,并委托上海美吉生物醫藥科技有限公司MiSeq建庫及生物多樣性測序,最后對樣品進行α-多樣性分析、真菌群落組成分析和樣本差異顯著性分析[16]。

1.2.2 玉米秸稈低溫降解菌初篩 稱取A、B樣品各0.5 g,放入研缽中,少量無菌鹽水研磨后轉入裝有49.5 mL無菌生理鹽水的三角瓶中,15 ℃、120 r/min,振蕩30 min[17]。振蕩結束后靜置30 min,吸取9 mL上清液移至裝有90 mL富集培養基中,15 ℃富集3 d[18]。采用稀釋梯度法制備10-1、10-3、10-5、10-7、10-9濃度稀釋液,分別涂布于馬鈴薯葡萄糖培養基,15 ℃倒置培養,挑取菌落劃線純化至纖維素平板培養基,反復純化,直到得到單菌落[19]。

1.2.3 玉米秸稈低溫降解菌復篩 將純化后的菌株點接在鑒別培養基上[20]。分別在0、5、10、15 ℃倒置培養10 d,培養結束后用1 mg/mL剛果紅染色1 h,1 mol/L的NaCl脫色1 h,觀察并用Scan 300菌落計數儀拍照記錄透明圈的大小,測定透明圈與菌落直徑的比值,以此為依據初步衡量降解纖維素能力的大小[21]。

1.2.4 液態發酵降解實驗 將純化后的菌株轉移至馬鈴薯葡萄糖培養基中,15 ℃培養3 d后按5%接種量轉移至液態發酵培養基,15 ℃、120 r/min振蕩培養[22]。15 d后將秸稈降解剩余物在1 mm過濾網內用大量清水沖洗,除去附著菌體和可溶性物質,在105 ℃條件下烘干至恒重,同時稱取秸稈剩余物干重[23]。計算秸稈相對降解率:

式中:R表示降解率,%;m0表示降解前秸稈干重,g;m1表示降解后秸稈干重,g。

1.2.5 菌種鑒定 將篩選得到的菌株點接至培養基,15 ℃恒溫培養5 d后觀察菌落形態,包括菌株的形狀、顏色、菌絲狀態等主要形態學特征[24]。真菌ITS區基因分析中引物合成及測序均由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成,將測序結果拼接,登陸NCBI網站(http://www. ncbi. nlm.nih. gov),獲得相似序列的物種信息,判斷菌屬。

1.3 數據處理

數據處理采用R語言和mothur(https://mothur.org/wiki/Main_Page)軟件進行分析作圖,通過對比Unite(Release 7.0 http://unite.ut.ee/index.php)真菌數據庫統計樣本的群落組成。

2 結果與分析

2.1 多樣性測序數據分析

2.1.1 多樣性測序結果 對玉米秸稈及根部土壤真菌群落進行測序,共獲得20715913個堿基(base,bp),被聚類為251個OTU,共拼接成82250個基因片段,平均長度為249.29 bp。

2.1.2α-多樣性分析 對測序結果進行α-多樣性分析以確定樣本內真菌群落的豐度及多樣性情況,見表1。

表1 樣本Alpha多樣性指數表

由表1可見,秸稈根部土壤的Sobs、Ace、和Chao指數高于玉米秸稈,說明秸稈根部土壤中的真菌群落豐富度較高;兩樣本的Shannon、Simpson指數較相近,即二者之間真菌群落結構相似,需要進一步對比分析;Coverage值均較高,表明樣本中序列被測出的概率高、群落覆蓋度廣,滿足后續真菌多樣性的分析[25]。

在相似水平97%上進行OTU聚類分析(Operational Taxonomic Units),利用mothur軟件進行分析并繪制Shannon曲線。Shannon指數隨著測序深度增加而趨于平坦,說明測序數據量足夠大,可以反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息,覆蓋范圍廣。從圖1可以看出,A樣本真菌群落水平多樣性高于B樣本,原因可能是:秸稈根部土壤存在著大量的微生物群落,與玉米秸稈根部存在著微生物的直接接觸,二者之間可能存在菌群交換,擁有共同的微生物菌群,彼此有很大機會成為各自的內生菌群,且土壤環境是植物微生物群的主要來源,所以微生物多樣性較玉米秸稈豐富,有待進一步研究[26]。

圖1 樣本真菌群落Shannon曲線

2.1.3 真菌群落Heatmap圖分析 根據樣本間豐度的相似性在屬水平上進行聚類,對樣本中豐度前30的真菌進行分析,獲得可以分類的真菌群落Heatmap圖,通過灰度變化與相似程度來反映不同秸稈群落微生物在屬水平上群落組成的相似性和差異性。

如圖2所示,Heatmap圖清晰的顯示了樣本中真菌群落的多樣性和豐度。結果表明,A樣本與B樣本優勢屬不同,A樣本中已知可分類的豐度較高的真菌菌屬依次為Guehomyces、Mortierella、Fusarium、Exophiala、Humicola、Cryptococcus、Cyphellophora、Monographella等;B樣本中已知可分類的豐度較高的真菌菌屬依次為Guehomyces、Leptosphaeria、Cystofilobasidium、Tetracladium等。樣本中共有的已知可分類的優勢菌屬為Guehomyces,豐度較高、活性較大,可能具有分泌纖維素酶的能力。

圖2 樣本真菌群落屬水平Heatmap圖

2.1.4 樣本差異顯著性分析 根據測序得到的真菌群落豐度數據,運用卡方檢驗(Chi-aquare test)、費舍爾檢驗(Fisher’ exact test),在門水平上對秸稈及根部真菌群落進行顯著性差異檢驗,評估樣本豐度差異的顯著性水平,通過比較得知樣本間的差異物種,如圖3所示。

圖3 樣本真菌門水平差異顯著性分析

從圖中可以看出,測序結果在門水平上可分為五類,分別為Basidiomycota(擔子菌門)、Ascomycota(子囊菌門)、Zygomycota(接合菌門)、unclassified_k_Fungi(未分類真菌)和Chytridiomycota(壺菌門)。左側柱形圖的長度表示該菌門在各樣本中的相對豐度,右側圖表示在95%置信區間上樣本間的比例差異,可以看出,A樣品與B樣品中Basidiomycota、Ascomycota、Zygomycota、unclassified_k_Fungi存在極顯著差異,Chytridiomycota無顯著性差異。

2.2 玉米秸稈低溫降解菌的篩選

從玉米秸稈及秸稈根部土壤中共分離出13株既能在以CMC-Na為唯一碳源的培養基上生長，且能產生明顯的透明圈的真菌菌株,說明這13株真菌具有分解纖維素的能力,由于菌株的降解能力與透明圈大小成正比,因此篩選出3株產酶能力較強的纖維素降解真菌，分別為FB1、FB7、FB8，通過比較0、5、10、15 ℃低溫下經剛果紅染色產生的透明圈與菌落直徑的比值，結合液態發酵測定3株真菌的降解率分別是27.66%、21.53%、23.01%；在0、5、10、15 ℃對透明圈最大的菌株(FB1)進行降解實驗，測得其水解產生透明圈直徑(cm)與菌落直徑比值(cm)分別為2.36、2.32、2.13、2.01,因此確定菌株FB1降解效果最佳,并對其進行菌屬鑒定。

圖4 菌株FB1不同溫度透明圈

2.3 玉米秸稈低溫降解菌的鑒定

2.3.1 形態學觀察 如圖5所示,菌株FB1在培養基上的菌落整體呈深綠色、圓形,與培養基結合緊密,菌落中心凸起,由內向外由顏色不同呈現3個同心圓環,向外依次為黃褐色、灰綠色、黃白色絨毛狀,邊緣整齊。

圖5 菌株FB1形態

2.3.2 分子生物學鑒定 菌株FB1培養至對數期,提取DNA后使用通用引物ITS1和ITS4引物序列進行擴增,PCR擴增采用20 μL體系,95 ℃、5 min;95 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、90 s,25個循環;72 ℃、10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,DNA片段清晰明亮無雜帶,大小在500 bp左右,如圖6。目的片段回收后送至美吉生物醫藥科技有限公司測序,測序結果與NCBI數據庫進行比對,結合FB1菌落形態特征及基因序列分析,確定該菌株屬于假枝孢霉(Cladosporiumpseudocladosporioides)[27]。

圖6 ITS序列PCR產物電泳結果

3 結論

本研究對玉米秸稈及秸稈根部土壤中真菌群落進行多樣性測序,α-多樣性分析、Heatmap圖分析及樣本差異顯著性分析發現,玉米秸稈及秸稈根部土壤真菌多樣性豐富,通過分離篩選確定菌株FB1降解效果最佳,培養溫度在0、5、10、15 ℃時透明圈與菌落直徑的比值分別為2.36、2.32、2.13、2.01,發酵15 d的降解率為27.66%,通過ITS測序得知FB1為假枝孢霉。綜上,通過高通量測序能夠預測可能分泌纖維素酶的真菌菌株,同時低溫篩選真菌降解菌可為低溫玉米產區解決秸稈過剩問題提供幫助。