氮源對低溫發酵臍橙果酒揮發性成分的影響

鄧山鴻,陳 鋼

(南昌大學食品學院,江西南昌 330047)

低溫發酵作為一種重要的發酵工藝,被廣泛應用于面包、酸奶等發酵食品中,對食品風味具有積極作用[1-2]。在發酵果酒中,白葡萄酒主要采用低溫發酵,發酵溫度為10～12 ℃,具有獨特的風味口感。臍橙果酒是兼具臍橙營養物質和酒精的消費產品,風味與口感尤為重要。研究表明,采用低溫發酵工藝釀制果酒,可保持果酒中較高含量的萜烯類物質,并促進酵母產生酯類物質,改善果酒品質[3]。低溫發酵改善果酒品質的同時,也有其天然缺陷,即發酵周期長,存在發酵延遲或停止的風險[4]。

添加外氮源可強化菌種發酵能力,縮短發酵周期,使發酵過程更平穩。一些研究表明氮源對促進酵母發酵具有明顯效果,并會影響果酒香氣物質種類和含量的差異性[5-7]。低溫發酵中也有少量應用氮源的文獻。Perez等[8]的研究表明,添加氮源可顯著縮短白葡萄酒低溫發酵時間。張斌等[9]的研究表明,添加氮源可促進荔枝酒低溫高糖發酵,提升乙醇和酯類物質的得率。目前,低于18 ℃的低溫發酵果酒普遍存在著發酵周期長的問題,而針對這一問題的研究還很少。對不同種類果酒而言,選擇不同的外氮源,在促進酵母發酵的效果上不同,同時也會對果酒的香氣成分造成影響[10]。因此,選擇臍橙果酒低溫發酵的外氮源時,既要保證果酒低溫發酵效率,也需考慮其對果酒香氣物質的影響。

本文以低溫發酵臍橙果酒為研究對象,選取了磷酸氫二銨(diammonium phosphate,DAP)、硫酸銨和碳酸氫銨作為外氮源,考察了不同氮源對低溫發酵臍橙果酒酒精度、發酵時間的影響,同時分析了其揮發性香氣成分,以期為臍橙果酒低溫發酵工藝提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臍橙原料 贛南信豐臍橙(可溶性固形物11.54%,總糖45.61 g/L);偏重亞硫酸鉀(食品級) 河南華興生物科技公司;果膠酶(5萬 U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;磷酸氫二銨(分析純)、硫酸銨(分析純) 西隴科學股份有限公司;碳酸氫銨(分析純) 北京索萊寶科技有限公司;釀酒酵母 中國工業微生物菌種保藏中心;營養瓊脂(WL)培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司;3-辛醇(色譜純) 薩恩化學技術(上海)有限公司。

酒精計 上海精密科學儀器有限公司;WYT-J型手持糖度計 成都光學廠;石英毛細管色譜柱HP-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 美國Agilent公司;氣相色譜質譜聯用儀(Agilent 6890N-5975B) 美國Agilent公司;50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取頭、頂空SPME進樣器 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍橙果酒工藝流程 臍橙→分選、清洗、去皮、破碎(加果膠酶)→壓榨→果汁(加果膠酶、SO2)→加熱→靜置→調整成分(接種酵母菌,加白砂糖、SO2)→控溫發酵→倒罐→陳釀→臍橙酒。

關鍵操作點:

分選、清洗:挑選果體偏黃色、色澤均勻、無明顯色差、表皮光滑、果形端正的臍橙,剔除霉爛果及雜質。用清水洗滌除去表面污物,以減少原料的帶菌量。

破碎榨汁:將去皮后的臍橙全果切成小塊置于打漿機中破壁。在破壁后的果漿中加入果膠酶100 mg/kg,SO250 mg/kg(按偏重亞硫酸鉀質量50%計,下同),均勻靜置2.5 h后進行榨汁。果汁榨出后再加入果膠酶15 mg/kg,水浴加熱至45 ℃,靜置澄清4 h,使得果膠充分水解。

調整成分:將澄清后的果汁分裝至250 mL錐形瓶中,調整糖度。根據預實驗,參考發酵所需達到的酒精度以及酵母對可溶性固形物的適應性[11],添加白砂糖使發酵初始可溶性固形物達22%,同時加入30 mg/L SO2。空白組不添加任何氮源,氮源組分別添加一定量的DAP、硫酸銨、碳酸氫銨。

酵母活化:將保藏的菌種接種至酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養基中活化,于28 ℃振蕩培養48 h后,放入4 ℃冰箱備用。

接種:按3%(v/v)接種釀酒酵母至含180 mL臍橙果汁的錐形瓶中。

主發酵:控溫14 ℃發酵,至可溶性固形物的含量穩定不變,視為主發酵結束。發酵過程中定期排出發酵產生的CO2,主發酵結束后倒罐,轉入陳釀階段。

陳釀:將主發酵完成后的酒樣置于12 ℃恒溫箱陳釀30 d。

1.2.2 單因素實驗 選取DAP添加質量濃度為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 (g/L),硫酸銨添加質量濃度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 (g/L),碳酸氫銨添加量1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 (g/L),進行發酵實驗,至可溶性固形物含量不變時發酵結束,記錄發酵時間,并測定臍橙酒酒精度。根據單因素實驗結果,確定DAP、硫酸銨、碳酸氫銨三種氮源的添加量。

1.2.3 酵母計數 根據確定的氮源添加量,在發酵過程中,采用平板計數法測定不添加氮源與添加DAP(0.4 g/L)、硫酸銨(1.0 g/L)、碳酸氫銨(1.5 g/L)的低溫發酵臍橙酒中的酵母總數。

1.2.4 基本理化指標檢測 可溶性固形物:糖度計;酒精度:酒精計;總糖、總酸等其他基礎理化指標的檢測參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.2.5 揮發性成分檢測 頂空-固相微萃取(HS-SPME)[12]:取8 mL臍橙酒樣品、10 μL 3-辛醇內標(400 μg/L)、3.0 g NaCl于20 mL樣品瓶中,密封,將樣品瓶于40 ℃ 攪拌平衡15 min后,將老化的萃取頭插入密封的樣品瓶中,頂空萃取40 min,然后在氣相色譜進樣口230 ℃解析3 min,采用GC-MS分析其揮發性成分。

GC條件:石英毛細管色譜柱HP-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm);起始溫度40 ℃,保留時間2 min,以5 ℃/min升至230 ℃,保留時間15 min;不分流進樣,載氣He,流速:1.2 mL/min。

MS條件:電子電離源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,進樣口溫度250 ℃,傳輸線溫度250 ℃,質量范圍33～400 amu。

定性與定量分析:實驗數據處理由GC-MS數據分析軟件系統完成,未知化合物經計算機檢索,同時與Wiley 7.0/NIST05檢索數據庫進行匹配,對比,并結合已有文獻進行定性分析。根據已知濃度3-辛醇內標物,以各揮發性物質的相對于內標物含量進行半定量分析。

1.2.6 香氣活性值(odor activity value,OAV)的計算

式中:FC(flavor compound)為揮發性香氣成分質量濃度;OT(odor threshold)為該揮發性化合物的香氣閾值。香味活度值反映出香味化合物對果酒感官貢獻的多少,通過數據對比,能夠體現不同組別的差異性。

1.2.7 感官評定 水果味、柑橘類味、橙味、青草味、薄荷味、花香味、香草味、酒精味、辛辣味共九種感官屬性評定特征在對臍橙果酒的感官評價中具有一定的代表性[13],感官評定以此為基礎。陳釀階段完成后,由15人組成的感官評定小組,對提供標準品與樣品的香氣特征強度進行評估,各香氣特征強度采用1～9分制(1:香氣特征強度非常弱,3:香氣特征強度較弱,5:香氣特征強度中等,7:香氣特征強度較強,9:香氣特征強度非常強),取平均值為評分結果。

1.3 數據處理

數據為各組處理3次重復的平均值,利用Microsoft Excel 2016統計分析,Spss 20進行方差分析,差異顯著性分析和主成分分析,Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

DAP是葡萄酒中最普遍添加的氮源,其不僅能促進酵母的發酵效率,同時能一定程度增加果酒的香氣物質[5]。在臍橙酒的低溫發酵中,DAP仍然具有較強促進發酵的效果。隨著添加量的增加,臍橙酒酒精度先升高后降低。在添加量達到0.4 g/L時,其酒精度最大,發酵時間最短,相對于未添加氮源組,酒精度增加了4.6%,發酵時間縮短了56%。研究表明,DPA添加濃度過高反而不利于酵母對氮源的吸收[14]。因此,后續實驗中選取0.4 g/L作為DAP組低溫發酵臍橙果酒的添加量。

圖1 不同質量濃度DAP對酒精度和發酵時間的影響

硫酸銨是發酵實驗中最常添加的氮源,具有一定的代表性。研究表明,硫酸銨在荔枝酒的低溫高糖發酵工藝中具有明顯強化菌種發酵能力的效果,促進了發酵過程中對糖的轉化效果,提高了醇和酯的得率[9]。由圖2可知,添加硫酸銨在低溫發酵臍橙酒中對于提高酒精度具有良好效果。硫酸銨的添加量為1.0 g/L時,其酒精度達到最大值,發酵時間為最短,相對于未添加氮源組,酒精度增加了5.3%,發酵時間縮短了44%。因此,后續實驗中選取1.0 g/L作為硫酸銨組低溫發酵臍橙果酒的添加量。

圖2 不同質量濃度硫酸銨對酒精度和發酵時間的影響

碳酸氫銨在果酒中有一定應用。在蘋果啤酒發酵研究中發現,碳酸氫銨可以提高酵母發酵力,促進酯類合成[15]。此外,碳酸氫銨會影響到一些重要的代謝途徑,如在抑制雜醇油的合成代謝方面效果明顯[16]。由圖3可知,碳酸氫銨的添加為1.5 g/L時,酒精度最高,發酵時間最短,相對于未添加氮源組,酒精度增加了5.2%,發酵時間縮短了22%。因此,后續實驗中選擇1.5 g/L作為碳酸氫銨組低溫發酵臍橙果酒的添加量。

圖3 不同碳酸氫銨添加量對酒精度和發酵時間的影響

根據單因素實驗可知,與未添加氮源的低溫發酵臍橙酒相比,添加DAP、硫酸銨、碳酸氫銨三種氮源均能明顯縮短發酵周期。其中添加DAP作為氮源的果酒,發酵時間最短;添加硫酸銨作為氮源的果酒,能達到的酒精度最高。添加DAP 0.4 g/L、硫酸銨1.0 g/L、碳酸氫銨1.5 g/L的果酒,分別縮短發酵時間56%、44%、22%,增加酒精度4.6%、5.3%、5.2%。

2.2 添加不同氮源時低溫發酵菌落總數的變化

酵母在未添加氮源的果酒中低溫發酵時發酵啟動緩慢、糖轉化效率低[17]。酵母發酵過程中菌落總數的變化如圖4所示。四組果酒發酵至第2 d時菌落總數達到最大值,隨發酵過程進行,酵母總數慢慢下降。添加三種氮源果酒中釀酒酵母的最大值(6.61、6.60、6.62 lg CFU/mL)與空白組(6.71 lg CFU/mL)有一定差異性。添加三種氮源的低溫發酵酒在第2 d時的酵母數較空白組小,可能是由于添加三種氮源的果酒中,酵母增殖的最大值點在此時間之前。在后續發酵過程中,除發酵末期外,添加三種氮源的果酒中酵母數量均高于空白組,說明三種氮源對于促進酵母發酵具有明顯效果。

圖4 不同種類氮源對發酵過程中酵母數量的影響

為進一步探究三種氮源添加對低溫發酵臍橙果酒的揮發性成分影響,進行了揮發性成分的定量分析。

2.3 添加不同氮源對低溫發酵臍橙酒基本理化指標的影響

香氣化合物檢測前,測定臍橙酒的基本理化指標。如表1所示,添加DAP、硫酸銨、碳酸氫銨三種氮源均能提高臍橙果酒的酒精度,硫酸銨與碳酸氫銨組酒精度較高。相應的添加三種氮源的臍橙酒,殘糖含量均低于空白組。由表1知,總酸含量最低的是空白組。低溫果酒的總酸含量較低,但氮源的添加導致果酒的總酸含量偏高[18],其中,添加DAP的果酒中總酸含量最大。揮發性酸會影響到果酒的感官品質[19],揮發性酸含量過高時使得酒體呈現不好的“醋香”。果酒中揮發酸主要是乙酸,由于低溫發酵果酒發酵周期長,揮發性酸一般較低,香氣協調[20]。氮源的添加會影響酵母的代謝途徑,進而減少揮發性酸的積累[21],由表1知,三種不同氮源果酒之間的揮發性酸含量差異性不顯著。

表1 臍橙酒的理化指標

2.4 添加不同氮源對低溫發酵臍橙酒揮發性成分的影響

對添加不同氮源組的揮發性成分的GC-MS分析結果見表2,添加三種氮源的臍橙果酒與未添加氮源的僅在揮發性成分含量上有所差異,在揮發性成分的種類上沒有差異。四種低溫發酵酒檢測出揮發性成分32種,其中高級醇類5種、萜烯類10種、中鏈脂肪酸類2種、乙酸酯類3種、乙酯類7種、醛酮類5種。

表2 不同氮源對低溫發酵臍橙酒揮發性成分含量的影響

高級醇指揮發性成分中六個碳原子以上的一元醇,其含量對果酒感官品質具有重要影響。適宜含量的高級醇能促進果酒風味的形成,但高級醇含量過高反而會降低果酒品質。通過對四種低溫發酵臍橙酒的揮發性成分分析發現,DAP組和硫酸銨組的高級醇總含量小于空白組,碳酸氫銨組的高級醇總含量最大,且高于空白組。與DAP組和碳酸氫銨組相比,碳酸氫銨組中的異戊醇和苯乙醇含量相較于空白組增加更明顯。苑振宇等[22]研究表明,碳酸氫銨對高級醇生成的影響顯著,且與碳酸氫銨的添加量有關。

萜烯類揮發性成分是果酒香氣中果香的主要來源[23]。由表2可知,D-檸檬烯、β-水芹烯、4-萜烯醇三種萜烯類化合物含量較高,明顯大于其他萜烯類化合物含量。萜烯類揮發性成分在溫度較高時很容易揮發,低溫發酵有助于萜類揮發性成分更好的保留,此外,加入氮源能夠影響酵母的代謝途徑,從而有利于萜烯類揮發性成分的積累[7]。由表2可知,三個氮源組中的萜烯類揮發性成分總含量均高于空白組,其中硫酸銨組的萜烯類揮發性成分總含量最高。D-檸檬烯是臍橙中的特征性揮發性成分,兼具增香和藥用價值[24],在萜烯類揮發性成分總量中的占比明顯高于其他種類的化合物。其中,DAP組和硫酸銨組果酒中D-檸檬烯高于空白組,且硫酸銨組中更高,而碳酸氫銨組低于空白組。β-水芹烯、4-萜烯醇兩種揮發性成分的含量在添加氮源果酒中均高于空白組,且兩種揮發性成分在碳酸氫銨組中與空白組相比增加最顯著。

癸酸和辛酸酵母發酵過程中重要的代謝物質,在大多數類果酒發酵中均有發現。本實驗中檢測到兩種酸,且以辛酸為主。中鏈脂肪酸影響一些基因的表達,被認為是制約酵母生長的物質[25]。辛酸的含量較大也是低溫發酵的一個特征,是酵母在低溫脅迫下物質代謝的結果[26]。由表2可知,三個氮源組中,碳酸氫銨組中的中鏈脂肪酸類揮發性成分總含量更高。

酯類揮發性成分分為乙酸酯和乙基酯兩類,其中乙酸酯是由醇類物質與乙酰輔酶A經由醇乙酰基轉移酶催化形成,乙基酯是由醇類物質和脂肪酸經由酰基轉移酶催化形成[27]。乙酸酯和乙基酯分別貢獻了果酒的果香和花香,是臍橙果酒中第二大類的揮發性成分。由表2知,同組中乙基酯總含量明顯大于乙酸酯總含量;其中添加三種氮源的臍橙酒乙酸酯總含量大于空白組,而乙基酯的含量少于空白組。與其他氮源組相比,乙酸酯含量最高的為DAP組,乙酸酯含量最高的為硫酸銨組。乙基酯類揮發性成分中僅有壬酸乙酯和十二烷酸乙酯在添加碳酸氫銨組中大于空白組。添加三種氮源的臍橙酒中,乙酸酯含量均大于空白組,這與其他研究一致[28]。與另外兩種氮源組相比,DAP組中酯類揮發性成分含量相對更高的為乙酸-2-苯乙酯、庚酸乙酯;硫酸銨組中含量相對更高的為乙酸乙酯、癸酸乙酯;碳酸氫銨組中含量相對更高的為乙酸癸酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸-3-羥基-乙酯、十二烷酸乙酯。

由表2可知,添加碳酸氫銨的低溫發酵酒中的醛酮類揮發性成分含量最高。醛酮類物質也具有相應的香氣特征[29],但因總含量較低,一般很難達到其香氣閾值,故對果酒的感官品質影響較小。

2.5 不同氮源低溫發酵臍橙酒主成分分析

對不同氮源組低溫發酵臍橙果酒的香氣成分各大類累積量進行主成分分析。由圖5可知，主成分1和主成分2貢獻率分別為56.08%、41.20%,累計方差貢獻率為97.28%,能較好的反映數據的整體。由不同氮源組的載荷圖知,空白組與主成分2有很高的正相關,DAP組與主成分2有很高的負相關,硫酸銨組與主成分1有很高的負相關,碳酸氫銨與主成分1有很高的正相關。由各類揮發性成分載荷圖知,高級醇、萜烯類、醛酮類與主成分1有很高的正相關性,說明這三類成分與碳酸氫銨的添加關系密切;乙酸酯類與主成分2有很高的負相關性,這說明此類成分與DAP添加關系密切;乙基酯類與中鏈脂肪酸與主成分2有很高的正相關性,說明這兩類成分與不添加氮源關系密切。

圖5 不同類化合物總量與不同組氮源主成分分析數據圖

2.6 不同氮源低溫發酵臍橙酒OAV

由表3知,在低溫發酵臍橙果酒中,揮發性成分含量大于香氣閾值的有癸醇、庚醇、辛酸、D-檸檬稀、4-萜烯醇、乙酸癸酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯,說明這些物質對果酒的香氣貢獻較大。高級醇含量較低,而由于癸醇和庚醇的香氣閾值也較低,故對香氣感官有一定貢獻。其中,庚醇在DAP和硫酸銨的影響下,OVA值變小,而在碳酸氫銨的影響下變大。由表3可知,癸醇、辛酸、丁酸乙酯、癸酸乙酯的OAV降低,說明這些揮發性成分在氮源的影響下對果酒香氣貢獻變小,其中辛酸和丁酸乙酯在DAP組中相較于空白組的減小量更大,癸醇和癸酸乙酯在碳酸氫銨組中相較于空白組的減小量更大;D-檸檬稀、4-萜烯醇、乙酸癸酯的OAV增加,說明這些揮發性成分在氮源的影響下對果酒香氣貢獻變大,其中D-檸檬稀在DAP組中相較于空白組增加量更大,4-萜烯醇和乙酸癸酯在碳酸氫銨組中相較于空白組增加量更大。

表3 不同氮源低溫發酵臍橙酒OAV值

2.7 不同氮源低溫發酵臍橙酒感官評定

由圖6可知,添加三種氮源的臍橙果酒在青草味、薄荷味、酒精味三種香氣特征比較中無明顯區別;在柑橘類味、橙味、辛辣味三種香氣特征中得分高于未加氮源組,其中硫酸銨與其他組相比,在橘類味和橙味香氣特征屬性中得分最高;在水果味、花香味、香草味三種香氣特征中低于未添加氮源組,且與其他氮源組相比,DAP組中的水果味香氣特征屬性得分更高,硫酸銨組中的花香味和香草味得分更高。水果味、花香味是低溫發酵的特征香味,添加氮源會削弱這些香氣特征,且相較于DAP和硫酸銨而言,碳酸氫銨的兩種香氣特征削弱更明顯。

圖6 不同氮源低溫發酵臍橙果酒的感官評定

3 結論與討論

本研究通過對比添加三種氮源與空白組的發酵實驗結果發現,磷酸氫二銨、硫酸銨和碳酸氫銨在縮短低溫發酵時間與提高酒精含量上具有顯著效果,酒精含量可提高4.6%～5.3%,發酵時間可縮短22%～56%。這對通過添加氮源的方式,克服低溫發酵周期長的缺點,具有一定的參考價值。四種臍橙果酒在不同揮發性成分含量上具有不同特征,且在不同感官屬性特征上具有一定的差異性。與其他氮源組相比,添加DAP的果酒中乙酸酯類揮發性成分的含量更高,添加硫酸銨的果酒中萜烯類和乙基酯類揮發性成分的含量更高,添加碳酸氫銨的果酒中高級醇類、高級脂肪酸類和醛酮類揮發性成分的含量更高。因此,在選擇低溫發酵氮源時,需綜合考慮酵母的發酵效率和氮源對果酒揮發性成分的影響。

影響酵母發酵的營養物質眾多,除本文選擇的三種氮源外,還有眾多營養素可作為研究對象。如果針對酵母低溫發酵時易缺乏的營養素加以補充,則促進酵母發酵效率和縮短低溫發酵時間的效果將更好,同時也將有利于果酒風味物質的積累。本文的不足之處在于確定不同氮源添加量時,以酒精度最高作為氮源添加量的參考標準。實際上,同一氮源在不同質量濃度下也會影響其揮發性成分含量和感官評定,需進一步的研究。