豆豉中丁硫克百威降解菌的篩選及鑒定

郭薇丹,肖 毓,林 欣,羅 煜,付湘晉

(中南林業科技大學食品科學與工程學院,湖南長沙 410004)

丁硫克百威(carbosulfan)是一種氨基甲酸酯類殺蟲劑,在水果、蔬菜等經濟作物中有著較為廣泛的應用[1],其本身是克百威的低毒化衍生物,化學名稱為2,3-二氫-2,2-二甲基苯并呋喃-7-基(二丁基氨基硫)N-甲基氨基甲酸酯,分子式為C20H32N2O3S，純品是褐色粘稠液體,能和二甲苯、丙酮、乙醇互溶,是一種高效廣譜的氨基甲酸酯類的殺蟲劑[2],丁硫克百威對昆蟲具有胃毒和觸殺作用[3]。其殺滅蟲害的機理主要抑制乙酰膽堿酯酶的活性[4]。其特點是脂溶性強、作用迅速、滲透力強、有較強的殘效等[5]。主要用來防治柑橘等水果及棉花、蔬菜、水稻、玉米、甘蔗等多種經濟作物上的蟲害,對蚜蟲的防治效果尤為突出[6]。

丁硫克百威殘留屬于較突出的非持久性農藥污染問題之一,在被重點監測的10余種禁用農藥中[7],克百威殘留超標率最為嚴重,在土壤[8]、糧食作物、果蔬、食用菌、茶葉等中均有檢出丁硫克百威殘留[9],檢出率范圍為0.96%～56.3%,超標率范圍為0.0017%～20.9%[10],是水胺硫磷超標率的2倍,甲基異硫磷超標率的8倍[11]。

農藥降解菌的篩選是當前農藥降解研究的熱點[12]。劉新等[13]從土壤中分離了一株可降解毒死蜱的曲霉和一株既可以降解毒死蜱同時也能降解甲胺磷的木霉。劉智等[14]對甲基對硫磷降解菌DLL-1進行誘變育種后得到了4株降解譜較寬的菌株,分別對辛硫磷、馬拉硫磷、鄰氨基酚等有不同程度的降解。Rousseaux等[15]從受污染較嚴重的土壤中篩選得到25株能對阿特拉津產生降解效應的微生物。鄭柳柳等[16]從生產工廠的排污口中篩選出13株細菌,其中一株假單胞菌AD1能在72 h內將濃度為0.3 g/L的阿特拉津幾乎完全降解。遲濤等[17]對低溫發酵條件下的乳酸菌對有機磷農藥的降解作用進行了研究,所選3株植物乳桿菌對樂果、久效磷均有降解促進的作用。陳芳芳[18]對發酵食品中氨基甲酸酯類農藥降解進行了研究,發現乳酸菌及霉菌對氨基甲酸酯類農藥的降解有促進作用。周欣偉[19]通過研究發酵食品中有機磷農藥的微生物降解,發現乳酸菌中磷酸酯酶的活性與有機磷農藥的降解促進作用成正比,微生物的發酵過程可以大大提高有機磷農藥的降解動力學常數。王晶等[20]研究了3株乳酸菌對7種有機磷農藥的降解作用,發現植物乳桿菌1.0343降解作用較強,3株乳酸菌對馬拉硫磷、倍硫磷、甲拌磷、甲基對硫磷的降解作用整體較強,而對敵百蟲、久效磷、樂果的作用整體較弱。趙靜等[21]從石河子大學農學院試驗站采集土樣15份,采用富集培養的方法篩選到1株丁硫克百威降解菌,鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。王新等[22]從原沈陽東北制藥廠區污染土壤中分離出4株對克百威、毒死蜱具有一定的降解能力的優勢菌種,為蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscircus)。余磊等[23]從楊凌某農藥廠排污口處的污泥中分離得到1株能有效降解克百威的細菌,鑒定為假單胞菌屬。喬潤香等[24]從廣東、安徽、貴州、山東、山西、河北、遼寧等地采集土樣中篩選得到克百威降解菌株,鑒定為酵母菌[25]。

上述文獻表明,目前,丁硫克百威的降解菌主要從土壤中篩選,均不能用于食品中降解丁硫克百威;如果以傳統發酵食品為分離材料,則更有可能篩選到可應用于食品的降解菌。本研究以豆豉為分離材料,經過馴化富集、平板劃線獲得單菌落,采用高效液相色譜法測定降解菌株對丁硫克百威的降解率,篩選降解率高的菌株;并分析這些降解菌株對丁硫克百威降解特性,為開發新型微生物農藥降解劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

老一品香瀏陽豆豉 從超市中購得;PDA培養基、MHA培養基 青島海博生物技術有限公司;丁硫克百威(>98%標準品),3羥基-丁硫克百威(>98%標準品) 北京世紀奧科生物技術有限公司;其他試劑 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

LC-20A高效液相色譜儀 配備紫外檢測器和LCsolition工作站,日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 無機鹽培養基:NaCl 0.5 g,NH4NO31.0 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,K2HPO41.5 g,(NH4)2SO40.5 g,超純水1 L,調節pH至7.0。

富集培養基:NaCl 1.0 g,KH2PO41.0 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖1.0 g,超純水1 L,調節pH至7.0。

牛肉膏蛋白胨培養基:蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,牛肉膏3.0 g,蒸餾水 1000 mL,瓊脂18.0 g,調節pH至7.0。

LB液體培養基:NaCl 10.0 g,酵母浸粉 5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,超純水1 L,調節pH至7.0[22]。

菌株富集培養及菌株降解丁硫克百威實驗中,需要在培養基中添加丁硫克百威,添加方法是,培養基滅菌、冷卻后在無菌條件下將丁硫克百威加入培養基中。

1.2.2 HPLC法測定丁硫克百威 根據國標(GB 23200.112-2018)進行測定[26]。將老一品香瀏陽豆豉研磨后,以二氯甲烷作為提取溶劑提取丁硫克百威[15],采用搖床振蕩方式常溫提取丁硫克百威10 min。

色譜條件:色譜柱為ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),選擇檢測條件為柱溫30 ℃,流動相為水∶甲醇(10∶90,V/V),流速1 mL/min,檢測波長280 nm,進樣量20 μL[27]。根據標準品保留時間定性,外標法峰面積定量。將丁硫克百威系列標準溶液分別測定響應的峰面積,以標準工作液的濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,利用峰面積及質量濃度得出丁硫克百威的標準曲線Y=37794X+12151,R2=0.9999。方法檢出限0.01 mg/L,定量限0.10 mg/L,回收率在91.51%～97.7%之間,相對標準偏差在2.22%～2.26%,符合國家NY/T 788-2018農藥殘留試驗準則中要求。

1.2.3 降解菌篩選

1.2.3.1 丁硫克百威降解菌株的富集 分別稱取豆豉20 g放入裝有180 mL富集培養基(丁硫克百威100 mg/L)的三角瓶中,將三角瓶中,置于35 ℃、180 r/min搖床上培養7 d。然后以10%的接種量轉接到丁硫克百威終濃度為200 mg/L的新鮮的富集培養液中,繼續培養7 d,此后依次逐漸增加富集培養基中丁硫克百威濃度,每次增加量為100 mg/L,直到最后富集培養基中的丁硫克百威濃度達到500 mg/L,最后將獲得的富集培養液用于菌株分離[28]。

1.2.3.2 丁硫克百威降解菌株的分離 采用10倍稀釋涂布法稀釋最終取得的馴化液,在無機鹽培養基固體平板上(添加丁硫克百威終濃度為500 mg/L)進行涂布,于30 ℃恒溫培養箱中倒置培養3 d,選擇在培養基上生長迅速、菌落規則的單菌落劃線于牛肉膏蛋白胨固體培養基以及PDA培養基上,對長出的菌落進行單菌落分離后轉接至試管中保存備用。

1.2.3.3 菌株對丁硫克百威的降解 將分離純化后獲得的菌株接種于裝有50 mL的LB液體培養基的錐形瓶中,在30 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床中10 °傾斜振蕩培養24 h,將此菌液作為菌株的擴增液。取擴增液在冷凍高速離心機中以4 ℃、10000 r/min條件下離心10 min,倒掉上清液,用滅菌的無機鹽液體培養基沖洗沉淀,離心沖洗3次。最后用無機鹽液體培養基進行稀釋,使菌體濃度達到107CFU/mL,作為種子液備用。取5 mL種子液與50 mL丁硫克百威濃度為500 mg/L的無機鹽液體培養基混合,以不接菌為對照,30 ℃、180 r/min搖床培養3、5、7 d,測定丁硫克百威的含量,篩選丁硫克百威降解量高于60%的菌株作為試驗菌株,并編號保存。

1.2.4 丁硫克百威降解菌株的鑒定 將篩選出的細菌采用通用引物27F/1492R進行PCR擴增。交由上海美吉生物醫藥科技有限公司使用TSINGKE DNA凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)切膠回收目的片段以相應引物測序,將測序結果與NCBI數據庫進行比對。通過GenBank下載相關菌株的rDNA序列,與測定的菌株序列儀器進行多重序列比對,利用MEGA4.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5 降解菌對丁硫克百威產物克百威、3-羥基丁硫克百威的降解活性 因為丁硫克百威在酸性環境中易水解成克百威及3-羥基丁硫克百威,在無機鹽培養基溶液中加入丁硫克百威至100 mg/L,調節溶液pH至3.0,將無機鹽培養基溶液置入恒溫搖床,待測得丁硫克百威濃度低于HPLC法檢測限后(<0.01 mg/L),將pH調節至7.0,按照1.2.3.3操作加入降解菌株,對照組加入相同體積的無菌水,30 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床培養3 d,采用HPLC法測定克百威以及3-羥基丁硫克百威[15]。

1.2.6 pH對降解菌降解丁硫克百威的影響 由于丁硫克百威在pH低于3的環境下極易水解,不具有參考價值,因此配制pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,以不加菌作為對照組,30 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床培養3 d,測定丁硫克百威降解率。

1.2.7 溫度對降解菌降解丁硫克百威的影響 在pH=7條件下,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,分別在4、10、20、25、30、35、40 ℃培養3 d,以不加菌作為對照組,測定丁硫克百威降解率。

1.2.8 降解菌降解丁硫克百威動力學特性 將高降解菌株,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,在30 ℃、pH=7的條件下放置在恒溫氣浴搖床進行處理。分別在1、2、3、4、5、6、7、8、9 d時取樣進行降解率的測定,進而分析4株菌株的降解動力學,每組設置3個平行,同時設置不加菌作為對照組進行比較。

1.2.9 丁硫克百威降解率的計算

降解率(%)=C1×100/C0

式中,C1:降解后培養液中丁硫克百威濃度(mg/L);C0:培養液中初始丁硫克百威濃度(mg/L)。

1.3 數據處理

采用Excel軟件進行數據統計、圖形擬合、繪圖。實驗結果通過SPSS Statistics軟件進行T檢驗。使用GraphPad Prism 7進行作圖。

2 結果與分析

2.1 降解菌對丁硫克百威的降解效率

通過對分離材料進行培養富集后。對所得菌液進行涂布平板法和平板劃線法,分離、純化,從而得到純菌落。最終得到14 株降解菌,標記為JJ-1～JJ-14。14種菌株在3、5、7 d時對丁硫克百威的降解率如表1所示。

表1 降解菌株對丁硫克百威的降解率

根據表1中數據進行顯著性分析,其中4株菌株JJ-1、JJ-4、JJ-5以及JJ-8的降解率優于趙靜等[21]在土壤中所篩選出的降解菌的降解率(63.98%),以及王新等[22]從污染土壤中分離出的降解菌的降解率(60%)。因此選擇JJ-1、JJ-4、JJ-5以及JJ-8進行后續研究。

2.2 丁硫克百威降解菌株的鑒定

對篩選所得的14 株中降解率較高的4株菌株進行測序鑒定,初步鑒定菌株JJ-1為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、JJ-4為畢赤酵母(Pichiapastoris)、JJ-5為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、JJ-8為柑桔青霉(Penicilliumcitrinum)。畢赤酵母是許多傳統發酵食品中的常見菌株,也已經用于飼料發酵,安全性較高[29]。

圖1 菌株JJ-1、JJ-4、JJ-5及JJ-8的系統發育樹

2.3 降解菌對丁硫克百威水解產物的影響

降解菌對克百威及3-羥基克百威的降解效果如圖2所示。通過比較對照組數據可以得出四株菌株均對克百威有降解效果(降解率51.39%～57.14%,無顯著差異),但只有菌株JJ-4對克百威及3-羥基克百威有較好的降解效果,JJ-4在3 d時對3-羥基克百威降解率達到73.24%。

圖2 降解菌對丁硫克百威水解產物的影響

2.4 pH對降解菌降解丁硫克百威的影響

通過圖3可以發現丁硫克百威自身水解速率隨pH的降低而加快,而在pH偏中性或堿性環境下,丁硫克百威比較穩定,pH對水解效果的影響與羅俊凱等[30]的研究相同。在pH偏堿性時,菌株JJ-1以及JJ-5不能表現出很好的降解活性。同時可以看出菌株JJ-4在pH5～9的范圍內均有較好的降解效果。

圖3 pH對降解率的影響

2.5 溫度對降解菌降解丁硫克百威的影響

由圖4可知,丁硫克百威自身的水解速率隨溫度的升高而加快,在高溫環境下丁硫克百威容易進行水解,溫度對水解效果的影響與羅俊凱等[30]的研究相同。在低溫環境下時(4 ℃),菌株JJ-1對丁硫克百威有15%左右的降解,其它3個菌株均不能表現出很好的降解效果,這是由于低溫環境影響了降解菌的生物活性。而在40 ℃時,菌株JJ-4、JJ-8表現出了超出丁硫克百威自身水解的降解效果。扣除丁硫克百威自身水解,JJ-1、JJ-5、JJ-8菌株在30 ℃左右時表現出最高降解效率,菌株JJ-4的降解效率在35 ℃左右最高,達72.96%,超出丁硫克百威自身降解率(41.68%)。

圖4 溫度對降解率的影響

2.6 降解菌降解丁硫克百威的動力學特性

通過計算9 d的降解率得出4種菌株的降解率曲線,如圖5所示,動力學擬合方程見表2。

表2 降解菌株對丁硫克百威的降解動力學方程式及其參數

圖5 降解菌株對丁硫克百威的降解率曲線

在pH=7,30 ℃條件下,丁硫克百威的自然降解動力學方程為Ct=10.872e0.1692d,相關系數r=0.9980,水解速率常數為0.1692,水解半衰期9.01 d。在菌株JJ-1作用下丁硫克百威的半衰期在4.06 d,在菌株JJ-4作用下丁硫克百威的半衰期在3.20 d。

3 結論

獲得4株能夠高效降解丁硫克百威及其代謝產物的菌株,菌株JJ-1為為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida),JJ-4為畢赤酵母(Pichiapastoris),JJ-5為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens),JJ-8為柑桔青霉(Penicilliumcitrinum)。

4株降解菌株對克百威都有一定降解效果,JJ-4對3-羥基克百威也有較好的降解效果,3 d時的降解率達73.24%。

菌株JJ-4在pH范圍5～9之間均表現出良好的降解效果,pH=8時對丁硫克百威降解率達到50.87%。35、40 ℃時JJ-4對丁硫克百威降解率超過78%,能很好的適應高溫環境。

菌株對丁硫克百威的降解速率符合一級動力學方程。菌株JJ-4降解丁硫克百威的動力學方程是Ct=36.189e0.1009d(R2=0.9912),半衰期3.20 d。