γ-聚谷氨酸生產菌株的鑒定及發酵培養基優化

張 雷,張 蕾,王玲莉,魏占波,李 杰,周 怡,丁 芳,高紀超,石元亮,*

(1.中國科學院沈陽應用生態研究所,遼寧沈陽 110016;2.中國科學院大學,北京 100049 3.吉林農業科技學院,吉林吉林 132000)

γ-PGA(γ-聚谷氨酸)是由谷氨酸單體脫水縮合形成的一種陰離子異性肽,骨架由γ-酰胺鍵連接,其側鏈為游離的羧基,分子量一般在104～2×106Da之間[1]。聚谷氨酸分子與水形成氫鍵連接后,使其具備了良好的水溶性、強保濕性、粘結性等功能[2]。根據分子量不同呈現出的功能差異,γ-PGA分別用于化妝品、食品、醫藥、農業等眾多領域[3-4]。γ-PGA對人體無毒無害,吸附性良好,形成的膠體穩定性強,常用作食品增稠劑和祛苦味劑等[5]。

γ-PGA生產方法有化學合成法、酶催化法、微生物發酵法等[6]。其中,微生物發酵的生產條件簡單、目標產物含量高,目前已經成為γ-PGA工業生產的首選方法。按照發酵中微生物培養狀態,又可將其分為固態發酵和液態發酵。相比于液態發酵,雖然固體發酵中γ-PGA的產量高,但是提取十分困難[7],難以實現工業化生產。現階段,國內外對γ-PGA發酵的研究仍集中在液體發酵。隨著工業中γ-PGA產量需求不斷增加,如何通過液體發酵提高γ-PGA產量是目前γ-PGA的產業化進程中最重要的任務之一。目前,對該問題的研究主要集中在菌株篩選、發酵工藝優化和基因工程改造等三個方向,并取得一定成果[8-10]。但由于聚谷氨酸代謝的調控基因眾多,通過單一基因的敲除、敲入或過表達,容易引起細胞內代謝的紊亂;同時,菌株篩選存在周期長和穩定性不佳等方面的問題,短期內難以滿足現實生產需求。因此,優化γ-PGA發酵工藝,尤其對培養基的優化仍是當前提高工業發酵生產γ-PGA產量的重要手段。目前,培養基優化試驗設計的方法主要有因子設計、響應曲面設計、田口設計、人工神經網絡設計等[11-14]。其中,響應面不僅可以從眾多因子中篩選出具有顯著效應的因子,作出正確評價,還能夠展示出主要影響因素的交互作用,從而高效地得到最優解,因而被廣泛應用[15-17]。但是由于培養基成分復雜、因子間交互作用等原因,人們難以對γ-PGA發酵優化進行全面而系統的研究,形成了目前γ-PGA生產中發酵產物濃度低、底物轉化率低等不利局面,導致其市場供應能力嚴重不足,阻礙了γ-PGA的商業化進程[10]。

菌株N-2是本實驗室篩選的一株γ-PGA生產菌株,當培養基中添加谷氨酸時顯示出強大的γ-PGA合成能力(γ-PGA的產量21.20 g/L)。本文通過對該菌株培養基組分優化,旨在進一步提高其發酵產量,降低生產成本,為其工業化應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N-2菌株 中科院土壤養分高效利用工程研究室保存;EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit 北京全式金生物技術有限公司;Taq PCR 試劑盒 北京百奧萊博科技有限公司;溶菌酶 北京索萊寶科技有限公司;聚谷氨酸標品 上海源葉生物科技有限公司;本試驗所用其余試劑 均為分析純。

OLB-200B歐萊博試驗室恒溫搖床 濟南歐萊博科學儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機TGL-16M 長沙湘儀離心機儀器有限公司;凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;GeneAmp 2700 PCR儀 美國賽默飛世爾科技公司;JY1000C電泳儀、JY04S-3C凝膠成像系統 北京君意東方電泳設備有限公司;BioSpec-nano核酸濃度測定儀 日本島津株式會社;UV755B分光光度計 常州三豐儀器科技有限公司;MLS-3751L-PC型高壓蒸汽滅菌器 松下健康醫療器械株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 液體LB培養基(Luria-Bertani medium,LB medium)(g/L):牛肉膏10,蛋白胨5,氯化鈉10,pH7.2;種子培養基(g/L):葡萄糖30,谷氨酸鈉10,酵母浸粉8,K2HPO4·3H2O 4,(NH4)2SO42,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.04,pH7.0;初始發酵培養基(g/L):葡萄糖 30,谷氨酸鈉30,酵母浸粉8,K2HPO4·3H2O 4,(NH4)2SO42,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.04,pH7.0;滅菌條件:115 ℃滅菌20 min,葡萄糖與其它物質獨立分裝,滅菌后混合。

1.2.2 菌種培養方法 種子培養:以1%接種量將甘油菌種接至50 mL種子培養基(250 mL三角瓶),37 ℃,220 r/min,恒溫振蕩16 h[18]。發酵培養:5%的種子液接至1.2 mL發酵培養基中(于24孔方形深孔板)[19],32.5 ℃,220 r/min,恒溫振蕩54 h。

1.2.3γ-PGA含量的測定 參考文獻[20],濁度法測定γ-PGA含量。取γ-PGA標品,配制成不同濃度的γ-PGA標準液;另取發酵液,移液槍充分吹打,3500 r/min離心25 min,取上清液,加入3倍體積的無水乙醇,4 ℃下靜置過夜,10000 r/min離心10 min,棄去上清液,加入等體積的無菌水溶解后,稀釋適當倍數,得待測液。分別在標準液和待測液中等體積加入5 g/L的CTAB溶液,常溫孵育3 min,測定吸光度A250,并繪制標準曲線并計算聚谷氨酸含量Y。

Y(g/L)=2 VCA250N

式中:CA250標準曲線中對應的聚谷氨酸濃度(μg/mL),V為待測液體積,N為稀釋倍數。

1.2.4 16s rDNA序列同源性分析及系統發育樹構建

1.2.4.1 基因組DNA的提取 按EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書進行。

1.2.4.2 16S rDNA的擴增和測序反應體系的構建 按照Taq PCR試劑盒說明書構建。引物[21]27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACCTTGTTACGACTT-3′);PCR擴增條件如下:94 ℃預變性5 min,1個循環;94 ℃變性30 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min 30s,35個循環;72 ℃后延伸10 min,1個循環,4 ℃保存。擴增產物的純化和測序工作由深圳華大基因科技有限公司(北京分公司)完成,測序結果提交GenBank數據庫(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/genbank/)。

1.2.4.3 系統發育樹構建 利用NCBI的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.c-gi)進行同源序列比對,根據比對結果選取相應的模式菌株序列[22];使用MEGA X軟件(https://www. megasoftware. net/)構建系統發育樹并確定菌株的分類學地位。

1.2.5 單因素試驗 參照文獻[23-26],以γ-PGA產量為目的指標,對碳源、氮源、無機鹽種類進行優化。選取等質量甘油、蔗糖、果糖、麥芽糖、檸檬酸替換初始發酵培養基中的葡萄糖;等質量的大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨等復合氮源替換復合氮源酵母浸粉;等質量的NH4NO3、NH4Cl、尿素等無機氮源替換(NH4)2SO4,其余成分均與 1.2.1所示的初始發酵培養基相同,于37 ℃、pH7.0,220 r/min條件下恒溫振蕩培養54 h,考察不同碳、氮源對γ-PGA產量的影響;在去除無機鹽的初始發酵培養基中逐一添加K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4(2 g/L),MgSO4·7H2O(0.1 g/L),MnSO4·H2O、ZnCl2·7H2O、Na2MoO4·3H2O(0.05 g/L),考察不同無機鹽對γ-PGA產量的影響。

1.2.6 PB試驗 參考文獻[27],以γ-PGA產量(Y)為響應值,選取單因素試驗的9個因素(葡萄糖、酵母膏和谷氨酸鈉、K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnCl2·7H2O、Na2MoO4·3H2O)為自變量,分別編號為A、B、C、D、E、F、G、H、I,考察培養基組分對發酵的影響。使用Minitab 18軟件進行N=12的PB試驗設計安排,每個因素取高(+)和低(-)兩個水平,高水平為低水平的1.25倍,見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設計因素與水平表

1.2.7 最陡爬坡試驗設計 參照文獻[28],依據PB設計試驗結果選出顯著影響γ-PGA產量的三個因子(葡萄糖、谷氨酸鈉、K2HPO4·3H2O),并根據因子的正負效應設定步長及變化方向,以逼近最佳響應面區域,確定響應面分析的中心點。正效應取PB試驗高水平,方向向上,負效應取低水平,方向向下。

1.2.8 響應面設計與分析 以PB試驗篩選出的因子為自變量,爬坡試驗的中心點為自變量零點,γ-PGA的產量作為響應值,利用minitab軟件設置三因素三水平(n=15)的Box-Behnken響應面試驗(見表2),并進行統計分析。上述所有試驗,每個試驗點均設置三次平行。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平表

1.3 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 22軟件one-way ANOVA方法進行方差分析,LSD法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。單因素試驗結果采用OriginPro 8.6軟件進行圖表繪制。PB試驗、響應面設計數據由軟件Minitab 18進行數據處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

試驗提取了N-2的基因組,經過PCR擴增、純化、測序后獲得1170 bp的16s rDNA核酸片段。通過Blast同源比對發現N-2菌株的16s rDNA與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)MT081485.1、MN696247.1、MK578252.1等核酸序列的相似度達99%。通過選取相應的模式菌株,利用Mega X軟件,以Aureibacillushalotolerans為外群構建系統發育樹并進行系統發育分析(圖1)。由圖可知:N-2菌株與Bacillussubtilis的進化距離最近,經過Bootstrap法評估,二者聚為同一分枝的支持率為86%,由此將N-2菌株鑒定為枯草芽孢桿菌,命名為BacillussubtilisN-2,將其16s rDNA核酸序列提交至Genebank,獲得接收號為MK027094.1。

圖1 基于鄰接法(Neighbor-Joining method,N-J method)構建的N-2菌株16S rDNA序列的系統發育分析(K-2模型,自展法采樣1000次)

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 不同碳源對發酵的影響 碳代謝是生物體中心代謝的核心,為生物體提供能量和有機碳骨架,是生物體生長的最重要能源物質之一。不同碳源對γ-PGA發酵產量影響的統計結果見圖2。由圖2可知:經不同碳源發酵后,γ-PGA的產量大小順序為:葡萄糖>蔗糖>果糖>甘油>麥芽糖>檸檬酸。多重比較分析表明:葡萄糖發酵后的γ-PGA的產量顯著(P<0.05)高于其它碳源,由此確定葡萄糖為本組試驗的最佳碳源。其原因可能是葡萄糖作為一種速效碳源,在發酵初期可以快速供給菌體營養物質,使菌體快速生長[29]。以檸檬酸為碳源的培養基,γ-PGA的產量非常低,這與前人研究相似[30]。可能是由于試驗菌株缺乏順烏頭酸活性,致使α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid,α-KG)合成受阻和檸檬酸的過度積累,導致細胞體內L-谷氨酸(γ-PGA合成前體)濃度下降,γ-PGA無法積累[31]。

圖2 不同碳源對γ-PGA發酵產量的影響

2.2.2 不同氮源對發酵的影響 氮源對生物體的生長和目標物的積累有重要的影響,一方面是生物體酶、結構蛋白等的最重要來源;另一方面可以作為代謝的前體物質,直接參與次級代謝[32]。不同氮源對γ-PGA發酵產量影響的統計結果見圖3。有機氮源方面,發酵后γ-PGA均產量順序為:酵母浸粉>大豆蛋白胨>牛肉蛋白胨,三者統計結果并無顯著差異。其中酵母浸粉營養成分為酵母來源,其營養結構與微生物較為相似,試驗選取酵母浸粉作為有機氮源來源。無機氮源試驗均產量順序為:NH4NO3>(NH4)2SO4>NH4Cl>尿素。NH4NO3發酵后γ-PGA均產量顯著(P<0.05)高于其它氮源,因此選取NH4NO3作為最適氮源。總體來看,使用有機氮源發酵后γ-PGA的平均產量高于無機氮源,其原因可能是有機氮源除了為菌體提供必要的氮元素之外,還提供很多必需的生長因子[33]。考慮到菌株發酵時間較長,試驗選用有機氮源和無機氮源搭配以延長氮源供應時間,此外有研究表明有機氮源、無機碳源與碳源存在明顯的交互作用[34]。

圖3 不同氮源對γ-PGA發酵產量的影響

2.2.3 不同無機鹽對發酵的影響 無機鹽是生物體生長中不可或缺的營養物質,其主要作為生理活性物質的調節劑參與生物體生理活性的調控,對培養基的氧化還原電位、滲透壓、酸堿度等影響很大[35]。不同無機鹽對γ-PGA發酵產量影響的統計結果見圖4。發酵后γ-PGA均產量順序為:K2HPO4·3H2O>MgSO4·7H2O>MnSO4·H2O>Na2MoO4·3H2O>ZnCl2·7H2O。統計結果表明:添加K2HPO4·3H2O發酵后γ-PGA產量顯著高于其它無機鹽。研究表明Mg2+、Mn2+,Mo2+,等金屬離子均有增產效果[24-26],因此后續研究中,考慮使用復合無機鹽展開試驗。

圖4 不同無機鹽對γ-PGA發酵產量的影響

2.3 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗的試驗設計及結果分析見表3和表4。T-檢驗結果表明,在顯著水平α=0.05的情況下,因素A、B、D顯著影響γ-PGA產量(P<0.05)。通過回歸分析發現,A、B的回歸系數大于0,D的回歸系數小于0,表明A、B為正影響因素,D為負影響因素。因此,試驗選取葡萄糖、谷氨酸鈉、K2HPO4·3H2O進行最陡爬坡試驗,考慮到經濟因素,其余因子含量選取低水平。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果

表4 PB試驗設計和分析結果

2.4 最陡爬坡試驗

由PB試驗可知,葡萄糖和谷氨酸鈉為正效應因素,K2HPO4·3H2O為負效應因素。試驗依據上述因素的正負效應,設定爬坡方向與步長,試驗設計及結果見表5。如表所示,第4試驗組中γ-PGA產量達到最大值,因此將該組水平確定Box-Behnken試驗的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

2.5 響應面設計與分析

以γ-PGA產量(Y)為響應值,采用Box-Behnken試驗設計對PB試驗篩選的3個顯著影響因子和最陡爬坡試驗得到的中心點作進一步的優化。Box-Behnken試驗結果與方差分析結果顯示見表6、表7。對表6結果進行多元二次回歸,得到回歸模型方程:

表6 Box-Behnken試驗設計與結果(g/L)

Y=28.26-2.231A+0.089 B-0.887C-2.909A2-2.519B2-2.927 C2+0.075AB+0.843AC+0.903BC。

由表7可知:模型中A、B的線性項,A、B、C二次項、以及BC的交互項對γ-PGA產量有顯著影響,模型失擬項P=0.129>0.05,說明二次多項回歸失擬不明顯,模型無需納入更高次冪函數。決定系數為R2=98.27%,調整后的決定系數R2(調整)=95.16%,模型的P值為0.001,說明模型與試驗數據擬合程度良好,擬合效果顯著,可以用于γ-PGA生產的理論預測。

表7 Box-Behnken設計試驗結果的方差分析

為了更直觀的看出兩兩交互的作用對γ-PGA產量的影響,試驗對回歸方程進行了可視化分析:利用Minitab18軟件繪制出等高線圖和響應曲面圖,結果見圖5～圖7。在等高線圖中,等高線圍成的區域長短軸之比越小(越接近圓形),說明因素之間的交互作用對響應值的影響越不顯著;在響應曲面圖中,響應曲面開口向下,呈閉合凸形,說明響應值存在極大值,反之存在極小值,若圖形不閉合則不存在極值[22,36-37]。谷氨酸鈉與K2HPO4·3H2O之間的交互作用見圖7,分析可知:等高線呈橢圓形,響應面曲面的坡度陡峭,說明谷氨酸鈉和K2HPO4·3H2O之間交互作用較強,γ-PGA產量對谷氨酸鈉和K2HPO4·3H2O 的變化比較敏感,二者對γ-PGA產量的影響顯著(P=0.043<0.05)。葡萄糖-谷氨酸鈉的交互作用(圖5)和葡萄糖-K2HPO4·3H2O的交互作用(圖6)中,等高線近圓形,響應面坡度平緩,說明葡萄糖-谷氨酸鈉、葡萄糖-K2HPO4·3H2O之間的交互較弱。葡萄糖-谷氨酸鈉間的交互作用和葡萄糖-K2HPO4·3H2O間的交互作用小于谷氨酸鈉-K2HPO4·3H2O之間的交互作用對γ-PGA產量的影響,三者兩兩交互均存在極值。

圖5 葡萄糖和谷氨酸鈉的交互作用對γ-PGA產量影響的等高線圖和響應曲面

圖6 葡萄糖和K2HPO4·3H2O的交互作用對γ-PGA產量影響的等高線圖和響應曲面

圖7 谷氨酸鈉和K2HPO4·3H2O的交互作用對γ-PGA產量影響的等高線圖和響應曲面

為取得最優解,試驗對所得的回歸擬合方程中的三個自變量(A、B、C)分別求一階偏導,并令?Y/?A=0;?Y/?B=0;?Y/?C=0,取得極值。解得:葡萄糖=42.9293 g/L,谷氨酸鈉=44.8485 g/L,K2HPO4·3H2O=2.39394 g/L。此時模型預測產量Y=28.8207 g/L。根據實際試驗情況稍作調整,并進行三次平行試驗,在葡萄糖=42.93 g/L,谷氨酸鈉=44.85 g/L,K2HPO4·3H2O=2.39 g/L時,得到γ-PGA均產量為28.51 g/L,與預測值相差較小,說明此模型能很好的預測實驗因素對γ-PGA產量的影響。

3 結論與討論

本試驗通過分子生物學方法對初始菌株進行了鑒定,確定了N-2菌株為枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisN-2)。研究針對γ-PGA發酵產量低下等問題,通過單因素試驗確定了該菌株最佳碳源為葡萄糖,酵母浸膏和NH4NO3分別為該菌株的最佳有機氮源和無機氮源;結合單因素試驗結果,采用PB設計和BBD試驗優化了發酵培養基的組分。最終,培養基優化后γ-PGA的發酵產量為28.51 g/L,比優化前提高了34.48%。

相比于正交試驗等常用設計,響應面法可以通過有限的實驗次數獲得更加精確的經驗模型,同時可以分析各因素的變化對響應值的影響。根據本研究結果:模型誤差僅為1.1%,由此,采用響應面法對菌株培養基進行優化是優化培養基,提高γ-PGA產量的有效方式。

目前來看,國內外γ-PGA的液態發酵產量總體不高。最主要的原因在于:隨著發酵液中γ-PGA濃度增加,發酵液粘度顯著上升,氧氣傳質系數明顯下降,細胞中能量代謝受阻,進而造成細胞生長異常。氧氣傳質問題現已成為液態發酵中γ-PGA產量提升的瓶頸。雖然目前有學者將血紅蛋白轉入γ-PGA生產菌株,取得了一定成效[38],但是提升的幅度依然不大;此外,發酵原料成本高、菌株產能低,也是γ-PGA商業化進程中的巨大障礙。因此,加強對γ-PGA合成調控的研究,結合合成生物學、系統生物學等,系統設計或改造γ-PGA合成的底盤生物,應該是今后研究的熱點,這也是本課組今后研究的重要方向。