鮮切處理對獼猴桃中γ-氨基丁酸富集的影響

侯 瑩,祁雪鶴,任 慧,洪詩雨,池宗豫,王鴻飛,許 鳳

(寧波大學食品與藥學學院,浙江寧波 315211)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種四碳非蛋白氨基酸,以游離態的形式廣泛地存在于脊椎動物、植物和微生物中[1]。GABA在動物中作為一種抑制性神經遞質,具有降血壓,防止動脈硬化等多種生理功效[2]。在正常生長的植物組織中,GABA的含量通常在0.3～32.5 μmol·g-1[3]。當在缺氧、鮮切處理、鹽脅迫等逆境條件下,植物中的GABA含量會迅速積累[4-5]。前期研究發現,不同切割強度對鮮切胡蘿卜中GABA的影響差異較大,且外源CaCl2處理能有效地誘導鮮切胡蘿卜GABA的富集[6]。高等植物中GABA主要是由L-谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)的作用下發生不可逆的脫羧反應而形成,隨后GABA又在氨基丁酸轉氨酶(GABA transaminase,GABA-T)的作用下,生成琥珀酸半醛(Succinic semialdehyde,SSA),SSA在琥珀酸半醛脫氫酶(Succinic semialdehyde decarboxylase,SSADH)的作用下,形成琥珀酸,最后進入三羧酸循環(Tricarboxylic acid cycle,TCA),這一代謝反應被稱為GABA支路[7-8]。此外,有研究表明高等植物中的GABA也可以由多胺(polyamine,PAs)降解產物轉化產生[9]。多胺降解途徑是以腐胺(putrescine,Put)、精胺(spermine,Spm)、亞精胺(spermidine,Spd)在二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)和多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)的催化下生成4-氨基丁醛,然后再經氨基醛脫氫酶(Aminoaldehyde decarboxylase,AMADH)的作用下生成GABA。

鮮切果蔬又名最小加工果蔬,微加工果蔬,輕度加工果蔬,即新鮮果蔬進行分級整理、清洗、切分、保鮮、包裝等處理,并使產品保持生鮮狀態的制品。因其具有新鮮、方便、衛生和快捷等優點受到消費者的青睞,逐漸成為城市果蔬消費的主流[10]。獼猴桃(Actinidiachinensis)含有豐富的營養物質,并且口感酸甜美味,易于去皮以及切分,適用于鮮切加工[11]。目前,大多數研究主要集中在如何控制獼猴桃產品品質和病原微生物的生長來延長其貨架期,有關于鮮切獼猴桃GABA的代謝研究卻鮮有報道。

本論文選取獼猴桃為研究材料,研究鮮切處理對其GABA的影響,明確在鮮切處理下獼猴桃中GABA富集機理,對改善產品的營養和功能品質具有重要的理論和實踐應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徐香獼猴桃 購自安徽省宿州市大土山果園,挑選完全成熟,大小均一,表面無機械損傷及病蟲害的獼猴桃作為實驗材料;GABA標準品 Sigma-Aldrich公司;氯化鑭 分析級,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;苯酚 分析級,國藥集團化學試劑有限公司;甲醇 色譜純,Sigma-Aldrich公司;腐胺、精胺 亞精胺標準品 分析純(T≥98%),上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為國藥分析純。

PAL-1型數顯測糖儀 遼寧賽亞斯科技有限公司;AFX-2001-U超純水機 上海純浦實業有限公司;SYNAPT G2超高效液相色譜儀 美國water公司;745型紫外分光光度計 上海美譜達科技有限公司;BPZ11D分析天平 德國賽多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 將果實新鮮、大小均勻、無鮮切處理、成熟度幾乎一致的獼猴桃用200 μL/L次氯酸鈉溶液浸泡消毒2 min,純水清洗后平鋪于實驗操作臺上瀝干表明水分。對獼猴桃進行不同方式的鮮切處理,切片(半徑4～6 cm,厚度2～3 mm),切丁(以切好的原片為基礎,切成2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的獼猴桃丁),將切好的獼猴桃置于鮮切盒(材質:塑料;尺寸:15 cm×10 cm×4 cm),每個鮮切組12盒樣品,每盒約100 g左右。未進行切割處理的完整獼猴桃作為對照,對照組共有12顆獼猴桃。于4 ℃,相對濕度90%條件下貯藏,分別于0、3、6、9 h取樣,貯藏期間鮮切組隨機取3盒樣品取樣,對照組隨機取三顆獼猴桃為樣品,并于液氮中快速冷凍,置于-40 ℃冰箱中待用,同時取鮮樣用于品質指標的測定。

1.2.2 GABA含量的測定 GABA含量的測定參照Hu[12]等的方法并做一定修改。取0.5 g的冷凍樣品在3 mL的濃度為 0.05 mol/L的氯化鑭溶液中進行提取,在室溫下搖晃15 min后用12000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加入2 mol/L氫氧化鉀(200 μL),振蕩5 min后用12000 r/min離心5 min。取0.4 mL上清液依次加入800 μL硼酸鹽緩沖液(pH9.0)、體積分數6%苯酚和5%次氯酸鈉,充分混勻后沸水浴10 min,并立即冰浴5 min。然后加入體積分數為60%的乙醇,混勻后采用紫外分光光度在645 nm測定吸光度。結果以mg/g FW來表示。

1.2.3 谷氨酸含量的測定 谷氨酸含量測定的方法參照參考Al-Quraan等[13]的方法并加以修改。取0.5 g的樣品在0.05 mol/L的氯化鑭溶液中進行冰浴研磨,將0.02 mL的冷凍樣品提取物加入0.2 mL的反應溶液中。反應溶液含有0.2 mL Tris-HCl(0.1 mol/L,pH8.3)、0.1 mLβ-NAD+(7.5 mmol/L)和1 U/mL谷氨酸脫氫酶懸液。在30 ℃孵育60 min后,記錄340 nm處吸光度的變化。谷氨酸水平以NADH標準曲線為基礎,每生成1 mmol NADH則消耗1 mmol谷氨酸,結果用mmol/kg FW來表示。

1.2.4 GAD活性的測定 GAD活性的測定參照Liao等[14]的方法并加以修改:將0.5 g冷凍樣品在3 mL含5 mmol/Lβ-巰基乙醇、0.5 mmol/L磷酸吡哆醛、2 mmol/L EDTA和100 g/L甘油的100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH5.8)中勻漿。提取的勻漿在10000 r/min、4 ℃下離心20 min,上清液即為粗酶液。將0.5 mL 酶提液加入含10 g/L 谷氨酸的0.2 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L,pH5.8)中,40 ℃水浴2 h,在水浴中煮沸終止反應。每小時反應溶液中1 μmol/L GABA的生成為GAD活性的一個單位。

1.2.5 GABA-T活性的測定 GABA-T活性的測定參照Wang等[6]的方法并加以修改:取0.5 g冰凍組織樣品在3 mL含有10%甘油、1 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、5 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)、1 mmol/L苯甲磺酰氟(PMSF)的100 mmol/L Tris-HCl(pH9.1)中均質,在12000 r/min下,4 ℃離心20 min,得粗酶液。反應體系由50 mmol/L三氯化氫(pH8.2),0.75 mmol/L EDTA,1.5 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PLP,16 mmol/L GABA。10%(v/v)甘油,4 mmol/L 丙酮酸和0.5 mmol/L 酶提取物組成。在30 ℃孵育60 min后,加入0.1 ml 100 mmol/L磺基水楊酸(SSA),使反應中止。GABA-T活性被定義為每小時催化生成1 μg丙氨酸為一個酶活單位。

1.2.6 多胺含量的測定 多胺的測定參照Zhu等[15]的方法并加以修改:取獼猴桃冷凍樣品1.0 g加入3 mL提前預冷的高氯酸溶液(5%,v/v)進行冰浴研磨,將研磨后樣品冰浴1 h,在4 ℃,15000 r/min下離心30 min。取2 mL上清液轉移至5 mL離心管中,加入2 mol/L NaOH(2 mL),再加入10 μL苯甲酰氯,渦漩20 s后在37 ℃水浴30 min。再加入飽和NaCl溶液(4 mL),混勻后用乙醚(2 mL)進行充分地萃取,在3000 r/min條件下離心5 min,取1 mL醚相用氮吹儀吹干,用色譜級甲醇(500 μL)溶解,最后得到待測定的多胺樣品。采用高效液相色譜進行多胺含量的測定。色譜柱為反相C18柱(150×3.9 mm,4 μm),柱溫30 ℃;流動相為甲醇和水(比例為10∶40,v/v);檢測波長230 nm;流速0.7 mL/min,進樣量10 μL。

1.2.7 DAO、PAO和AMADH活性的測定 DAO和PAO的活性測定參照Gao等[16]的方法并加以修改:冷凍樣品(2.0 g)在5.0 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中均質,在12000 r/min、4 ℃下離心20 min,上清液即為粗酶液。反應體系中含有2.0 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.5),0.2 mL 4-氨基安替比林/N,N-二甲基苯胺顯色溶液,0.1 mL辣根過氧化物酶(250 U/mL),0.5 mL酶提取液。分別加入0.5 mL Put溶液(20 mmol/L)和0.5 mL Spd+Spm混合溶液(各20 mmol/L)啟動反應,進行DAO和PAO活性測定。在555 nm處吸光度值每變化0.001被定義為酶活的一個單位。

AMADH的方法測定基于Petrivalsky等人[17]的方法,并做了一些修改。將冷凍樣本在含5 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA和10%蔗糖的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中勻漿。在4 ℃、12000 r/min離心30 min,上清液即為粗酶液。反應體系中含有100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0),1 mmol/L NAD+和1 mmol/L ABAL,加入0.5 mL粗酶液啟動反應。在340 nm測定吸光值,每分鐘的吸光度變化0.001,被定義為該酶活性的一個單位。

1.2.8 菌落總數測定 菌落總數參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》測定。

1.2.9 可滴定酸的測定 可滴定酸的測定參照劉小陽等[18]的方法:取50 g鮮樣研磨后離心,取3 mL上清液加5 mL蒸餾水,再滴加3～4滴酚酞溶液,用0.1% NaOH溶液進行滴定,至出現淡紅色,記下NaOH溶液的用量。重復測定3次。

1.2.10 可溶性固形物含量測定 可溶性固形物的含量測定參照郭丹等[19]的方法:取一定量的新鮮樣品研磨,勻漿過濾測定,采用PAL-1型數顯測糖儀測定可溶性固形物含量,重復3次。

1.2.11 維生素C的測定 維生素C的測定參照何靖柳等[20]的方法:取5 g新鮮樣品加入適宜的2%草酸研磨,離心后取1 mL上清液用已經標定好的1,2-二氯酚靛酚滴定,至出現粉紅色且在15 s內不褪色為止,記下染料的用量。重復測定三次。

1.3 數據處理

采用Origin Pro 9.0和SPSS 21.0軟件進行數據處理分析,用鄧肯氏多重比較方法進行差異顯著性檢驗,P<0.05為差異顯著。以上指標均取3個平行樣,重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 不同損傷強度對獼猴桃中GABA含量的影響

由圖1可知,經過鮮切處理的獼猴桃中GABA的含量高于未經處理的獼猴桃,與切片組相比,切丁組的GABA含量更高,且GABA含量在貯藏期間呈先上升后下降趨勢,在貯藏時間為6 h時切丁組中的GABA含量達到了峰值。這可能是由于鮮切處理嚴重破壞了獼猴桃細胞膜結構,使細胞質中的鈣離子和氫離子含量增加,激活了GABA代謝的相關酶活性,進而促進了GABA的積累[21]。同時初步確定在鮮切處理脅迫條件下獼猴桃中GABA富集的最佳鮮切形式為切丁,最佳貯藏時間為6 h,故取切丁組進行下一步實驗。

圖1 損傷強度對獼猴桃中GABA含量的影響

2.2 鮮切處理對谷氨酸含量、GAD活性以及GABA-T活性的影響

2.2.1 鮮切處理對谷氨酸含量的影響 由圖2可知,對照組和切丁組的谷氨酸含量在總體上呈下降的趨勢,可能在較低的貯藏溫度下對獼猴桃存在著低溫脅迫,提高了GAD活性,使獼猴桃中谷氨酸轉化成GABA[5]。貯藏過程中,切丁組谷氨酸含量在前6 h顯著低于對照組(P<0.05)。谷氨酸是GABA支路中合成GABA的前體,這可能是切丁處理激活GABA支路促使谷氨酸轉化合成GABA[22]。

圖2 鮮切處理對獼猴桃中谷氨酸含量的影響及NADH標準曲線

2.2.2 鮮切處理對GAD和GABA-T活性的影響 由圖3A可知,對照組的GAD活性在前3 h并無顯著性差異,在6 h迅速升高，可能是較低的貯藏溫度下對獼猴桃存在著低溫脅迫,激活了對照組中GAD活性[4]。切丁組中的GAD活性在貯藏期間并無顯著性差異,且切丁組的GAD活性顯著高于對照組(P<0.05)。結果表明,鮮切處理能提高獼猴桃中GAD活性,促進谷氨酸向GABA轉化,使得GABA的積累,也進一步解釋了切丁獼猴桃中谷氨酸含量降低的原因。對照組的GABA-T活性在貯藏期間無顯著變化,而切丁組中的GABA-T活性呈現先增加再下降的趨勢。與對照組相比,切丁組的GABA-T活性顯著(P<0.05)低于對照組(圖3B)。GAD是GABA支路的限速酶,兩者對植物中GABA的積累起著至關重要的作用。Koike等[23]發現,用CO2處理番茄果實,其體內的GABA含量顯著增加,這主要歸因于CO2處理降低了GABA-T的活性,減緩了GABA的降解。本研究發現,切丁獼猴桃的GABA-T活性顯著低于對照組(圖3B),這表明鮮切處理后GABA含量的提高可能和較高的GAD活性和較低的GABA-T活性有關,這與Deewatthanawong等[24]的研究結果相一致。

圖3 鮮切處理對GAD和GABA-T活性的影響

2.3 鮮切處理對多胺含量的影響

鮮切處理對獼猴桃中多胺(腐胺、精胺、亞精胺)含量的影響見圖4。切丁組中的腐胺含量在前6 h無顯著變化,之后迅速減少;對照組在前6 h逐漸增加,然后開始下降,這可能是在貯藏前期,較低的DAO活性促進了腐胺的積累,在貯藏后期,隨著DAO活性的提升,腐胺開始降解;與對照組相比,切丁處理顯著的抑制了腐胺的產生(圖4 A)。由圖4B可知,對照組中的精胺含量在貯藏期間無顯著變化,而切丁組的精胺含量呈下降趨勢。對照組中的亞精胺含量呈先上升再下降的趨勢,而切丁組的亞精胺含量隨著貯藏時間逐步下降,并且顯著低于對照組(圖4C)。這些結果表明,經過鮮切處理顯著降低了獼猴桃中腐胺、精胺和亞精胺的含量(P<0.05),從而激活獼猴桃中的多胺降解途徑,促進GABA積累。

圖4 鮮切處理對獼猴桃中多胺(腐胺、精胺、亞精胺)含量的影響

2.4 鮮切處理對胺氧化酶活性的影響

由圖5A可知,對照組和切丁組的DAO活性均在前6 h逐步上升,在6 h時到達最大值,隨后逐漸下降。與對照組相比,鮮切處理顯著增加了DAO的活性。切丁組的PAO活性在前6 h迅速增加,并在6 h時達到最大值,之后緩慢下降。與對照組相比,切丁組的PAO活性顯著增強(圖5B)。由圖5C可知,對照組獼猴桃中AMADH活性在貯藏期間緩慢增加,而切丁組中AMADH活性在前3 h顯著增強,并在3 h達到最大值,之后逐漸下降。AMADH屬于醛脫氫酶,它能夠將植物中多胺經胺氧化酶(DAO和PAO)氧化產生的4-氨基丁醛直接進行脫氨反應生成GABA[15]。Wu等[25]研究發現,在厭氧脅迫下,福鼎白茶大約37%～47%的GABA產生于多胺降解途徑。在本研究中,低溫貯藏略微提升了對照組中DAO和PAO的活性,與對照組相比,切丁組的獼猴桃具有更高的DAO、PAO和AMADH活性(圖5A、5B和5C)。這可能是切割處理激活了多胺氧化酶的活性,促進更多的多胺降解成GABA。然而,多胺代謝是由多種信號轉導途徑控制的一個非常復雜的過程,還需要進一步的研究[26]。

圖5 鮮切處理對獼猴桃中胺氧化酶(二胺氧化酶、多胺氧化酶、4-胺基丁醛脫氫酶)活性的影響

2.5 鮮切處理對菌落總數、可滴定酸、維生素C、可溶性固形物含量的影響

菌落總數是用來評價鮮切果蔬安全性以及貨架期的指標。據報道[27],鮮切果蔬的菌落總數通常不超過106CFU·g-1。圖6A表明,鮮切獼猴桃菌落總數在4 ℃貯藏期間持續增長,但在貯藏時間分別為0、3、6、9 h時菌落總數未超過106CFU·g-1,仍然在可食用范圍內。如圖6B所示,在貯藏期間,切丁組的可滴定酸含量呈下降趨勢,但與對照組相比沒有顯著性差異(P<0.05)。對照組和切丁組的可溶性固形物含量在貯藏期間都呈下降趨勢,且在6 h后切丁組的可溶性固形物含量顯著低于對照組(圖6C)。獼猴桃以VC含量高而著稱,有著“VC之王”的美譽,VC也是衡量獼猴桃果實貯藏品質的重要指標。由圖6D可知,在貯藏期間,切丁組和對照組在較短的貯藏時間內(9 h)VC含量并無顯著性差異。這些結果表明,在此切割處理(切丁)和貯藏條件下(4 ℃和9 h),較好地保持了鮮切獼猴桃的品質。

圖6 鮮切處理對菌落總數、可滴定酸、維生素C、可溶性固形物含量的影響

3 結論

GABA是逆境條件下生物體緩解細胞酸化對自身毒害作用的產物[28]。大量證據表明,當植物受到缺氧脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫和鮮切處理脅迫時,GABA會大量積累以緩解脅迫環境對植物造成的損傷[22,29]。在本研究中,低溫貯藏略微提升了對照組獼猴桃的GAD、DAO和PAO活性,促進了對照組中谷氨酸的降解,同時鮮切處理可顯著提高獼猴桃中GABA的積累,相對于對照組,切丁獼猴桃中GAD、DAO、PAO和AMADH活性提高顯著,GABA-T活性被抑制。

果蔬經過鮮切處理后,結構和組織會遭到破壞,營養物質也會隨之流失,變得容易腐爛。在本研究中,最大菌落總數、VC和可滴定酸含量在對照組和切丁組之間均無顯著性差異,而切丁組的可溶性固形物含量略低于對照組,這可能與貯藏溫度(低溫)和短時間(9 h)有關。由此可知,鮮切處理誘導鮮切果蔬中GABA的富集可能具有普遍性,在確保產品感官品質和食用安全性基礎上,應用鮮切加工誘導GABA的合成有望成為提高果蔬產品營養保健功效的重要手段,也是鮮切果蔬加工保鮮技術研究的發展方向。