北五味子多糖提取工藝優化及其對LPS刺激巨噬細胞線粒體膜電位的保護作用

許夢然,王迦琦,高婧雯,葛俊宏,申 野,李 坦,孫 新,*

(1.北華大學醫學院,吉林吉林132013;2.吉林省分子老年醫學重點實驗室,吉林吉林132013;3.北華大學藥學院,吉林吉林 132013)

北五味子是中華傳統中藥,為木蘭科,五味子屬植物,呈不規則的球形或扁球形,直徑5～8 mm,傳統中醫認為北五味子較南五味子為佳[1],其主要分布于東北三省[2],含有木脂素、多糖、色素、有機酸、氨基酸等多種成分[3-6],多糖是北五味子的主要生物活性成分,藥理作用廣泛,在保肝、抗氧化、抗衰老、增強免疫等方面都有一定的療效[7-9]。

研究表明,線粒體膜電位的改變與細胞的氧化應激反應密切相關[10-11]。線粒體是細胞“能量工廠”[12],每時每刻為機體提供能量,線粒體內膜作為細胞有氧呼吸重要場所之一,其在呼吸鏈電子傳遞過程中會產生超氧陰離子等活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),若其產生過量會導致線粒體功能障礙進而造成細胞損傷、凋亡或死亡[13],ROS是誘導細胞線粒體膜電位發生改變的關鍵介質[14]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜主要成分,LPS在體內可以通過細胞信號轉導途徑激活多種免疫細胞,被廣泛用于構建細胞氧化損傷模型或炎癥模型[15-17]。

現有文獻中,關于北五味子多糖提取方法大多為酶解提取法、超聲波輔助法、水提醇沉法,其中酶解法是通過生物酶破壞植物細胞壁結構,促進其生物成分溶出,但此方法對生物酶專一性要求較高,且提取出的多糖粘稠不易干燥[18-19];超聲波輔助法是利用超聲波的“空穴作用”,破壞植物細胞的細胞壁及細胞膜,此法易引起多糖活性成分減少且發生改變[20]。水提醇沉法是通過不同時間、溫度、料液比及次數作為變量將植物中多糖成分浸提出來,操作簡單安全,且不易破壞細胞生物活性成分,是多糖提取中常用的提取方法[19]。

近年來有關北五味子多糖的藥理作用研究日益增多,如北五味子多糖能夠通過抑制谷丙轉移酶、谷草轉氨酶的表達發揮對小鼠肝臟的保護作用,也可以促進小鼠巨噬細胞的吞噬能力,調節NO分泌水平等[21-22],但有關北五味子多糖對線粒體膜電位的保護作用研究較少。因此本文在水提醇沉法基礎上采用四因素三水平正交分析方法提取北五味子多糖,使用LPS構建小鼠巨噬細胞(RAW264.7細胞)損傷模型,探討北五味子多糖對線粒體膜電位的保護作用,為北五味子的綜合研發提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

北五味子 選自長白山脈野生五味子;RAW264.7細胞 北華大學生命科學中心;胎牛血清、DMEM細胞培養液 美國Gibco公司;維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(水溶性VE,VE-TPGS)、脂多糖(LPS) 美國Sigma公司;無水乙醇、葡萄糖標準品、Bradford蛋白檢測試劑盒、FRAP總抗氧化能力檢測試劑盒、細胞活性氧檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 中國碧云天。

Infinite M200 PRO酶標儀 美國Beckman公司;TH4-200倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;MCO-18AICUVL-PC二氧化碳培養箱 日本Panasonic公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 北五味子多糖提取及純化 稱取洗凈干燥的北五味子粉碎后過40目篩,選擇一定的提取溫度、提取時間、提取次數、提取料液比,通過水提醇沉提取北五味子多糖,熱水浸提后,將多糖溶液濃縮至500 mL,3000 r/min離心除去糖溶液中北五味子殘渣,使用分液漏斗緩慢加入約4倍體積無水乙醇至乙醇濃度達到70%,醇沉過夜后,2000 r/min離心,棄去上清,沉淀經無水乙醇洗脫放入鐵盤平鋪均勻后真空干燥,得到北五味子粗多糖[23]。將粗多糖干燥后稱量,以5%比例溶于水進行反復凍融初步去除蛋白:糖溶液凍于-80 ℃冰箱內過夜,次日取出至完全融化,12000 r/min高速離心6 min后,棄去蛋白沉淀后再將上清凍于-80 ℃冰箱,重復此步驟,反復凍融直至無蛋白沉淀析出即可;使用氯仿、正丁醇以4∶1配制Sevag溶液[24],Seavg溶液與糖溶液以2∶1的比例混合,使用振蕩器劇烈振蕩1 h,4000 r/min離心15 min,上層溶液為糖溶液,中間層為蛋白質層,下層溶液為有機試劑,回收糖溶液,重復此操作直至中間層無蛋白析出;最后將糖溶液裝于3500 Da的透析袋中,流水透析24 h,去除糖溶液中葡萄糖、無機鹽等小分子雜質,凍干得到北五味子多糖。根據以下公式計算北五味子多糖得率:

式中,m北五味子多糖為純化后的北五味子多糖的質量,m北五味子為北五味子原材料的質量。

1.2.2 單因素實驗 根據1.2.1北五味子多糖提取過程進行大量預實驗后,排除對多糖得率影響較小的提取因素,最終選定提取料液比1∶30 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時間3 h和提取次數2次進行單因素實驗,研究4個因素對北五味子多糖得率的影響。

1.2.2.1 提取料液比對北五味子多糖得率的影響 在提取溫度為90 ℃,提取時間為3 h,提取次數為2次的條件下,設定提取料液比在1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL,考察不同提取料液比對北五味子多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度對北五味子多糖得率的影響 在提取料液比為1∶30 g/mL,提取時間為3 h,提取次數為2次的條件下,設定提取溫度在50、60、70、80、90、100 ℃,考察不同提取溫度對北五味子多糖得率的影響。

“還怕！一百個男人還不夠哩！”不知誰，她的聲音沒有人接受，空洞地在屋中走了一周，最后聲音消滅在白月的窗紙上。

1.2.2.3 提取時間對北五味子多糖得率的影響 在提取料液比為1∶30 g/mL提取溫度為90 ℃,提取次數為2次的條件下,設定提取時間在1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h,考察不同提取時間對北五味子多糖得率的影響。

1.2.2.4 提取次數對北五味子多糖得率的影響 在提取料液比為1∶30 g/mL,提取溫度為90 ℃,提取時間為3 h的條件下,設定提取次數為1、2、3、4次,考察不同提取次數對北五味子多糖得率的影響。

1.2.3 四因素三水平L9(34)法確定提取北五味子多糖提取工藝 單因素實驗初步確定提取參數變量范圍后,使用四因素三水平正交分析評估四項因素、四因素間的效應及相互作用對北五味子多糖得率的影響。該設計中4個獨立變量共有9種組合,參數變量水平設置見表1。

表1 實驗因素水平

1.2.4 多糖含量測定 利用苯酚硫酸法測定北五味子多糖總糖及葡萄糖含量[25-27]。取干燥葡萄糖配制濃度為100 μg/mL的葡萄糖標準液,精密量取葡萄糖標準液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于干凈試管內,分別加入去離子水至1 mL,配成濃度為0、10、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖溶液,北五味子多糖配制成為100 μg/mL糖溶液,加入5%三氯乙酸、15%三氯乙酸不斷研磨,離心取上清后加入2 mL 6 mol/L的鹽酸,96 ℃水浴2 h,流水冷卻后加入2 mL 6 mol/L氫氧化鈉搖勻,標記為樣品一,未處理的100 μg/mL北五味子多糖溶液為樣品二,將樣品一、樣品二及不同濃度葡糖糖溶液依次加入6%苯酚0.5 mL,濃硫酸2.5 mL,劇烈振蕩,置于沸水中加熱10 min,室溫靜置30 min,490 nm處檢測吸光度值。以光密度為縱坐標(Y),不同葡萄糖濃度為橫坐標(X),繪制葡萄糖標準曲線,分別將樣品一所得吸光度、樣品二所得吸光度帶入標準曲線,所得X值與北五味子多糖濃度的比值即為北五味子多糖總糖含量及北五味子多糖葡萄糖含量。

1.2.5 北五味子多糖的DPPH自由基清除率測定 取無水乙醇及DPPH粉末配制2×10-4mol/L的DPPH工作液,將北五味子多糖、VE-TPGS均稀釋為不同濃度(25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL),實驗組分別于96孔板中加入200 μL不同濃度北五味子多糖、VE-TPGS,再加入200 μL DPPH工作液;實驗對照組分別于96孔板中加入200 μL不同濃度北五味子多糖、VE-TPGS,再加入200 μL 蒸餾水;空白組中分別于96孔板中加入200 μL DPPH工作液,再加入200 μL 蒸餾水,按照以下公式進行計算清除率[28]:

式中,A1為不同濃度北五味子多糖及VE-TPGS加DPPH測得的吸光度;A2為不同濃度北五味子多糖及VE-TPGS加蒸餾水測得的吸光度;A0為蒸餾水加DPPH測得的吸光度值。

1.2.6 北五味子多糖的羥自由基清除率測定 首先依次配制濃度均為6 mmol/L的FeSO4和水楊酸及過氧化氫溶液,將北五味子多糖、VE-TPGS均稀釋為不同濃度(25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL),實驗組于96孔板中每孔加入50 μL不同濃度北五味子多糖或VE-TPGS,再加入50 μL FeSO4、水楊酸及過氧化氫;實驗對照組于96孔板中每孔加入50 μL不同濃度北五味子多糖或VE-TPGS,再加入50 μL FeSO4、蒸餾水及過氧化氫;空白組組于96孔板中每孔加入50 μL蒸餾水,再加入50 μL FeSO4、水楊酸及過氧化氫,按照以下公式進行計算清除率[29]:

1.2.7 北五味子多糖的總抗氧化能力檢測 利用FRAP總抗氧化能力檢測試劑盒對北五味子多糖的總抗氧化能力進行檢測,抗氧化物可以還原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)產生藍色的Fe2+-TPTZ,通過測定其在593 nm吸光度值計算樣品中的總抗氧化能力。將FRAP標準品稀釋至不同濃度(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/mg),北五味子多糖、VE-TPGS均稀釋為不同濃度(25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL),配制FRAP工作液,將工作液與樣品溶液在 96孔板中混合均勻,測其吸光度,根據FRAP標準品吸光度繪制標準曲線,將不同濃度北五味子多糖及VE-TPGS吸光度值帶入標準曲線,得到總抗氧化能力[30]。

1.2.8 細胞活性氧檢測 利用ROS檢測試劑盒對LPS誘導巨噬細胞產生的活性氧進行檢測,DCFH-DA熒光探針本身沒有熒光,在進入細胞內后,細胞酯酶將其水解生成DCFH,活性氧可以氧化DCFH生成有熒光的DCF,并利用其檢測活性氧水平。將含有10% FBS的1640培養液的RAW264.7(6×104個細胞/孔)細胞鋪在6孔板中過夜,設置空白組、模型組、北五味子多糖組(100、200 μg/mL)、空白對照組在等體積培養液中培養;模型組使用LPS(1 μg/mL)處理24 h,其余組先使用不同濃度多糖預處理24 h后,再加入LPS(1 μg/mL)處理24 h,置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。然后吸去上清液,用無血清培養基配制10 μmol/mL的DCFH-DA熒光探針,將其加入到 6孔板中,覆蓋細胞表面,37 ℃細胞培養箱孵育20 min,用無血清培養基沖洗細胞 3次,熒光顯微鏡下進行觀察熒光染色情況,使用Image J圖像處理軟件對熒光圖片進行分析,計算得到各組細胞染色的熒光強度,探索北五味子多糖對ROS產生的影響作用。

1.2.9 細胞線粒體膜電位檢測 利用線粒體膜電位檢測試劑盒對LPS誘導巨噬細胞后線粒體膜電位變化進行測定,JC-1是一種可廣泛用于檢測線粒體膜電位的熒光探針。在線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體的基質中,產生紅色熒光,線粒體膜電位下降,紅色熒光減少,可根據熒光判斷細胞線粒體膜電位的變化,細胞培養方法同1.2.8。培養后細胞吸去上清液,PBS洗滌細胞,在6孔板中加入1 mL細胞培養基及1 mL JC-1染色工作液,充分混勻后37 ℃細胞培養箱孵育20 min,棄去上清,每孔加入1 mL JC-1染色緩沖液洗滌細胞3次,最后棄去上清每孔加入2 mL細胞培養基,熒光顯微鏡下進行觀察,使用Image J圖像處理軟件對熒光圖片進行分析,計算得到各組細胞染色的熒光強度,探索北五味子多糖對線粒體膜電位的保護作用。

1.3 數據處理

所有實驗重復三次,數據表示為Mean±SD。正交統計分析結果通過SPSS19.0軟件進行分析,其余結果均使用GraphPad Prism Version 6(One-way ANOVA)進行分析,并且在P<0.05差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同提取料液比對多糖得率的影響 以不同料液比為單因素變量,分析其對多糖得率的影響,如圖1所示,料液比在1∶10～1∶30范圍內時,多糖得率呈明顯的上升趨勢,隨著料液比的增加,多糖得率開始下降,可能由于料液比過小,溶液黏度大,不利于活性成分擴散,得率較低,而料液比過大,會影響溶劑間熱傳遞,不利于多糖提取[31]。料液比為1∶20、1∶30、1∶40時多糖得率明顯較高,在料液比為1∶30時,多糖得率可達到7.32%±0.11%,故選此三點進行正交試驗。

圖1 不同料液比對多糖得率的影響

2.1.2 不同提取溫度對多糖得率的影響 以不同溫度為單因素變量,分析其對多糖得率的影響,如圖2 所示,溫度在50～90 ℃時,多糖得率呈明顯的上升趨勢,隨著溫度的進一步增加,多糖得率開始下降,可能由于溫度較低時,多糖分子移動速度較慢,得率較低,而提取溫度過高會影響多糖的穩定性,也會導致得率下降[32]。溫度為80、90、100 ℃時多糖得率較高,提取溫度為90 ℃時,多糖得率為7.81%±0.14%,故選此三點進行正交試驗。

圖2 不同提取溫度對多糖得率的影響

2.1.3 不同提取時間對多糖得率的影響 以不同時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)為單因素變量,分析其對多糖得率的影響,如圖3 所示,提取時間在1.0～3.0 h時,多糖得率呈明顯的上升趨勢,隨著時間的延長,多糖得率開始下降,研究表明,在一定時間多糖得率會隨時間的延長而升高,超出該時間范圍,多糖會因水解過度而導致得率下降[33]。提取時間為2.5、3.0、3.5 h時多糖得率較高,提取溫度為3.0 h時,多糖得率為6.27%±0.06%,故選此三點進行正交試驗。

圖3 不同提取時間對多糖得率的影響

2.1.4 不同提取次數對多糖得率的影響 以不同提取次數(1、2、3、4次)為單因素變量,分析其對多糖得率的影響,如圖4所示,提取次數在1～2次時,多糖得率呈明顯的上升趨勢,提取次數過少導致多糖提取不充分,隨著提取次數的增多,多糖得率趨于平衡,未發生明顯變化,增加提取次數對多糖的得率已無明顯影響。提取次數為2次時,多糖得率為6.81%±0.25%,由于提取次數為4次時,對多糖得率無明顯影響,故選擇提取次數為1、2、3次時進行正交試驗。

圖4 不同提取次數對多糖得率的影響

2.2 四因素三水平正交分析法得到北五味子多糖的提取方案

根據圖1～圖4得到結果進行正交試驗,如表2～表3所示,方差分析中F值和P值用于檢驗模型的顯著性,其中，料液比、提取次數對多糖得率有顯著影響(P<0.05)，而提取溫度、提取時間對多糖得率影響不顯著(P>0.05)，根據R值、方差平方和及F值可知,對多糖得率影響最大的因素為提取的料液比,其次為提取次數,而提取溫度,提取時間對多糖得率的影響較小,北五味子多糖提取條件為A3B2C2D3,即料液比1∶40,提取溫度90 ℃,提取時間3.0 h,提取次數為3次,在此條件下，經過驗證實驗,北五味子多糖得率可達到10.72%。

表2 正交實驗結果

表3 北五味子多糖得率的方差分析

2.3 北五味子多糖的總糖及葡萄糖含量檢測

利用葡萄糖標準品稀釋成不同濃度得到葡萄糖標準曲線如圖5所示,得到線性回歸方程y=0.0073x-0.0359,R2=0.9988,北五味子多糖C=100 μg/mL時,樣品一吸光度值為0.58±0.01,根據公式可得,提取的北五味子多糖的總糖含量為84.28%±2.03%,樣品二吸光度值為0.19±0.01,根據公式可得,北五味子多糖葡萄糖含量為30.26%±1.12%。

圖5 葡萄糖標準曲線

2.4 北五味子多糖的體外抗氧化能力檢測

如圖6A所示,北五味子多糖與VE-TPGS在25～1600 μg/mL時對DPPH自由基的清除率成劑量依賴式增加,北五味子多糖的DPPH自由基清除率為9.78%±2.18%～71.92%±1.01%;VE-TPGS的DPPH自由基清除率為9.34%±1.37%～59.24%±1.31%,北五味子多糖及VE-TPGS清除DPPH自由基的IC50值分別為602.52、1388 μg/mL,結果表明北五味子多糖DPPH自由基清除能力顯著優于VE-TPGS(P<0.05)。

如圖6B所示,北五味子多糖在25～1600 μg/mL時對羥自由基的清除率成劑量依賴式增加,北五味子多糖的羥自由基清除率為40.16%±1.01%～83.06%±0.21%;VE-TPGS的羥自由基清除率為47.79%±0.89%～50.03%±1.59%,北五味子多糖及VE-TPGS清除羥自由基的IC50值分別為34.24、34.05 μg/mL,結果表明北五味子多糖與VE-TPGS相比,具有更強的羥自由基清除能力(P<0.05)。

如圖6C～6D所示,FRAP標準曲線為y=0.4924x+1.1366,R2=0.9996,將不同濃度北五味子多糖吸光度值帶入標準曲線后可知,北五味子多糖在25～1600 μg/mL時的總抗氧化能力成劑量依賴式增加,北五味子多糖的總抗氧化能力為(0.14±0.01)～(0.28±0.01) mmol/mg;VE-TPGS的總抗氧化能力為(0.04±0.02)～(0.16±0.00) mmol/mg。結果表明北五味子多糖的總抗氧化能力優于及VE-TPGS(P<0.05)。

圖6 北五味子多糖抗氧化能力檢測

2.5 北五味子多糖對LPS誘導RAW264.7細胞產生ROS的抑制作用

如圖7所示,7A～7D為別為對照組、模型組、不同濃度多糖組(100、200 μg/mL)細胞的ROS熒光染色情況,7E為ROS染色的熒光強度分析,與圖A對照組相比,圖B LPS模型組中熒光染色細胞增多,熒光強度明顯上調(P<0.001),表明LPS刺激巨噬細胞后,ROS水平升高,而圖7C～7D北五味子多糖處理組與LPS模型組相比,熒光染色細胞呈劑量依賴式減少,熒光強度下調(P<0.001),表明北五味子多糖能夠有效抑制LPS刺激巨噬細胞后ROS的表達水平。

圖7 北五味子多糖對LPS誘導RAW264.7細胞中ROS含量的影響(n=3)

2.6 北五味子多糖對LPS誘導RAW264.7細胞后線粒體膜電位的保護作用

如圖8所示,8A～8D分別為對照組、模型組、不同濃度多糖組(100、200 μg/mL)細胞的線粒體膜電位熒光染色情況,8E為線粒體膜電位染色熒光強度分析,圖A對照組中熒光染色細胞較多,線粒體膜電位偏高,LPS模型組與對照組相比熒光染色細胞減少,熒光強度下降(P<0.001),表明LPS刺激巨噬細胞后,細胞線粒體膜電位下降,而圖8C～8D北五味子多糖處理組與LPS模型組相比,熒光染色細胞呈劑量依賴式增多,熒光強度上調(P<0.01),表明北五味子多糖能夠有效保護LPS刺激巨噬細胞的線粒體膜電位。

圖8 北五味子多糖對LPS誘導RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響(n=3)

3 討論

本研究在熱水浸提法基礎上通過四因素三水平正交分析方法對北五味子多糖進行提取,分析了不同提取料液比、提取次數、提取溫度、提取時間對北五味子多糖得率的影響,確定了北五味子多糖的提取方案為料液比1∶40,提取溫度90 ℃,提取時間3.0 h,提取次數為3次,所提取的北五味子多糖的總糖含量為84.28%±2.03%、葡萄糖含量為30.26%±1.12%。

氧化應激是指機體受到刺激時,抗氧化系統與氧化系統無法平衡,導致組織損傷,與多種疾病密切相關[34-35]。自由基生成過多,可破壞細胞DNA與蛋白質,導致機體抗氧化酶活性減低[36-37],引發衰老,而衰老細胞蛋白錯誤折疊,亦可促進氧化應激發生[38]。王珊珊等[39]發現,北五味子多糖具有較強的抗氧化活性,本研究中北五味子多糖清除DPPH自由基的IC50值為602.52 μg/mL,清除羥自由基的IC50值為34.24 μg/mL,總抗氧化能力(0.14±0.01)～(0.28±0.01) mmol/mg,均呈劑量依賴性增加且明顯優于VE-TPGS(清除DPPH自由基的IC50值為1388 μg/mL;清除羥自由基的IC50值為34.05 μg/mL;總抗氧化能力:(0.04±0.02)～(0.16±0.001) mmol/mg)(P<0.05)。

ROS可通過破壞DNA穩定性誘導氧化應激反應繼而導致多種疾病的發生[40-41],抑制ROS的生成也是評價體外抗氧化能力的重要標準[42]。線粒體是生命活動的調控中心,它不僅是 ROS的主要來源,也是ROS作用的主要靶點[43]。LPS的合成及轉運是一個復雜的過程,它在調節免疫系統的同時可進一步誘導ROS生成[44],繼而導致線粒體功能紊亂,線粒體膜電位下降。因此,本研究通過對LPS刺激巨噬細胞后ROS及線粒體膜電位檢測,研究北五味子多糖對ROS的清除作用及對線粒體膜電位的保護作用。結果表明,與對照組相比,LPS刺激巨噬細胞后,ROS水平升高,熒光強度上升(P<0.001);線粒體膜電位下降,熒光強度減低(P<0.001),在加入北五味子多糖處理后,ROS含量顯著降低,熒光強度減低(P<0.001);線粒體膜電位升高,熒光強度上升(P<0.01)。本研究表明:北五味子多糖減少由LPS誘導的巨噬細胞中ROS水平,進一步證實其具有較強的抗氧化活性,并能夠抑制線粒體膜電位下降,進而穩定線粒體膜電位。

4 結論

多糖作為北五味子的主要活性成分,具有毒副作用小,藥理作用廣泛等優點,在本研究中明確北五味子多糖具有較強體外抗氧化活性,在細胞實驗中能夠通過抑制LPS誘導巨噬細胞后產生的ROS進而保護線粒體膜電位。在未來研究中,將進一步對北五味子多糖是否能夠通過其他路徑保護線粒體膜電位,維持細胞正常生理功能進行探討,為長白山特色藥物北五味子研發利用提供理論依據。