超聲波、紫外線、超聲波聯合紫外線對鮮切香菇多酚氧化酶與過氧化物酶的鈍化及其機理研究

吳 詠,金 建,付秀麗,田 蕾,丁德勝,舒 暢,鄭淇心

(西南科技大學生命與科學工程學院,四川綿陽 621010)

香菇是我國的傳統食用菌,其營養豐富、味道鮮美,并具有一定的生理活性,深受人們的喜愛。隨著城市化和生活節奏的加快,鮮切蔬菜逐漸成為蔬菜消費的新趨勢。然而,褐變尤其是酶促褐變的發生會造成產品色澤差,嚴重影響消費者的感官接受度。多酚氧化酶(PPO)與過氧化物酶(POD)廣泛存在于植物組織結構中。相關研究表明,PPO是引起鮮菇發生酶促褐變的主要酶,且褐變度與PPO活性正相關,其原因在于PPO能將鮮菇中的多酚類物質進行氧化聚合而引起褐色變化[1-2]。POD作為另一關鍵酶,它能催化過氧化物對酚類、黃酮類物質發生氧化作用,然后再進行脫水、聚合,從而導致組織的褐變[3]。因此,為保證鮮切產品的質量,必須從根本上控制褐變的發生,鮮切香菇鈍酶的研究具有重要的經濟意義。

近年來,物理加工技術在鮮切果蔬上的應用逐漸成為本領域的研究熱點之一。輻照處理[4-6]、微波處理[7]、超聲處理[8-10]、脈沖強光處理[11-12]均能抑制果蔬PPO與POD的活性,從而達到減輕褐變的目的。周磊等[13]發現超聲處理雙孢蘑菇60 min后,PPO活性仍高達81.8%;超聲協同20 mmol/L蘋果酸處理60 min后,PPO活性為12.6%。Cheng等[10]研究表明,在溫度55～75 ℃范圍內,與單獨熱處理相比,超聲協同熱鈍化PPO酶活的D值(酶活降低90%所需的時間)降低了1.3～3倍。由此可見,超聲波技術能夠用于鮮切蔬菜酶活的鈍化。然而,單獨的超聲波處理效果并不是太理想,需要尋求一種或幾種處理進行聯合處理,以達到更好的酶活抑制效果。目前的研究,大多都是將超聲波與熱處理、超聲波與有機酸處理相結合,但是熱或有機酸介質的引入,可能會導致營養素的損失加劇,產品安全性也可能會受到威脅。

超聲波與紫外線在一定程度上既能殺滅物體表面的微生物,也能鈍化酶活,其產品安全性相對較高,成本較低。相對其它熱物理加工而言,這兩種處理方式在短時間內不會引起溫度的大幅度升高。因此,本文對比研究了單一紫外線、單一超聲波、超聲波聯合紫外處理對引起鮮切香菇發生褐變的兩種主要酶(PPO、POD)的鈍化效果,并初步探討了作用機理,以期為鮮切果蔬的前處理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

當日采摘的新鮮香菇(LentinusedodesBerk. sing) 購自綿陽青義福潤萬家超市;KBr(光譜純) 國藥集團化學試劑有限公司;鄰苯二酚、愈創木酚、沒食子酸等 均為國產分析純。

KH-300SP型雙頻數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;SWCJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;5805 R臺式冷凍離心機 德國艾本德公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司;Freezezone 12 L凍干機 美國LABCONCO實驗設備公司;U-3900H紫外分光光度計 日本HITACHT公司;X’Pert Pro X-射線衍射儀 荷蘭帕納科公司;Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀 美國PE儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 挑選大小均勻、結構完整的香菇,洗凈并瀝干水分,切成厚度約2 mm薄片,封口包裝,然后進行紫外線、超聲波以及紫外線聯合超聲波處理。紫外線處理:將上述樣品置于紫外超凈工作臺(有效波長254 nm),根據前期單因素試驗結果,設置紫外線處理劑量為1.8 kJ/m2(紫外強度2 W/m2、處理時間15 min);超聲波處理:將準備好的樣品置于雙頻超聲清洗器中,根據前期單因素實驗和正交試驗結果,設定雙頻順序工作模式為20與40 kHz交替工作100 s、超聲溫度20 ℃、超聲功率密度70 W/L、超聲時間15 min;紫外聯合超聲波處理:雙頻順序工作模式為20 kHz超聲波與40 kHz超聲波交替工作100 s,超聲處理參數為溫度15 ℃、超聲功率密度70 W/L、超聲時間15 min,超聲處理結束后,立即進行紫外線處理,劑量為1.8 kJ/m2(紫外強度2 W/m2、處理時間15 min)。所有樣品處理結束后立即測定PPO與POD酶活、褐變度與多酚含量,每個樣品重復三次處理,每個處理平行測定三次,對照組不作任何處理。

1.2.2 多酚氧化酶(PPO)的提取及酶活測定

1.2.2.1 PPO粗酶液的提取 取1.0 g香菇樣品,加入預冷的pH7.0磷酸鹽緩沖液3.0 mL,在冰浴條件下研磨勻漿并轉移到離心管中,再用7.0 mL磷酸鹽緩沖液沖洗研缽,合并提取液,4 ℃下5000 r/min離心10 min,上清液即為PPO粗提液,收集并于4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2.2 PPO粗酶液的活性測定 PPO活性的測定采用比色法[14],將0.5 mL鄰苯二酚加入到2.0 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中,然后加入0.5 mL酶提取液,立即于波長410 nm下測定吸光值,2 min后再次測定吸光值,以不加酶提取液的反應液作為空白對照,1個酶活單位定義為每1 min吸光度變化0.01。PPO酶活計算公式如下:

式(1)

式中:ΔA410為反應時間內吸光值的變化,比色波長410 nm;V為提取酶液總體積,mL;Δt為酶促反應時間,min;W為樣品鮮重,g;Vt為測定時所用酶液體積,mL。

最終結果以PPO相對酶活表示:

式(2)

式中:APPO處理組為經超聲、紫外、或超聲聯合紫外處理后的PPO酶活;APPO未處理為對照組(未經處理)的PPO酶活。

1.2.3 過氧化物酶(POD)的提取及酶活測定

1.2.3.1 POD粗酶液的提取 POD的提取參照李合生的方法[15],并略作改動。稱取1.0 g香菇樣品,置于研缽中,加入預冷的0.1 moL/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)2.0 mL,在冰浴條件下進行研磨提取并轉移至離心管中,再用7.0 mL磷酸緩沖液沖洗研缽,合并提取液,4 ℃下4000 r/min離心10 min,上清液即為POD粗提液,收集并于4 ℃保存待用。

1.2.3.2 POD粗酶液的活性測定 取一只試管,加入0.1 moL/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)2.0 mL、酶液1.0 mL、0.05 mol/L愈創木酚1.0 mL,混勻,再加入1.0 mL 2% H2O2并立即計時,再次混勻并迅速倒入比色皿中,于470 nm波長下進行比色,從第20 s開始記錄初始值,隨后每隔30 s記錄一次,每組共記錄4個數據。空白對照用緩沖液代替酶液,1個酶活單位定義為每1 min吸光度變化0.01。POD酶活計算公式如下:

式(3)

式中:ΔA470為反應時間內吸光值的變化,比色波長470 nm;V為提取酶液總體積,mL;Δt為酶促反應時間,s;W為樣品鮮重,g;Vt為測定時所用酶液體積,mL。

最終結果以POD相對酶活表示:

式(4)

式中:APOD處理組為經超聲波、紫外線、或超聲聯合紫外處理后的POD酶活;APOD未處理為對照組(未經處理)的POD酶活。

1.2.4 褐變度(BI)的測定 褐變度(BI)的測定采用韓春然等[14]的方法,并稍作修改,稱取1.0 g香菇切片于研缽中,加入5.0 mL蒸餾水并研磨1 min后,轉移至15 mL離心管中,用蒸餾水沖洗研缽2次,合并,以5000 r/min離心10 min,定容至25 mL,在波長為410 nm處測定其吸光度值,結果以相對褐變表示:

式(5)

式中:A410處理組為經超聲、紫外、或超聲聯合紫外處理后的香菇研磨液在波長410 nm處的吸光度;A410對照組為對照組的香菇研磨液在波長410 nm處的吸光度。

1.2.5 總多酚含量的測定 總多酚的測定采用Gao等[16]的方法,并稍作修改,稱取1.0 g香菇切片于研缽中,加入5.0 mL蒸餾水并研磨1 min后,轉移至15 mL離心管中,用蒸餾水沖洗研缽2次,合并,5 000 r/min離心10 min。移取1.0 mL上清液,加入1.0 mL福林酚試劑,漩渦振蕩10 s,加入7% Na2CO3溶液10 mL,振蕩10 s,用去離子水定容至25 mL,暗處靜置1 h后在75 0 nm處測吸光值,以沒食子酸作標準曲線并計算總酚含量。結果以多酚相對含量表示:

式(6)

式中:C處理組為經超聲、紫外、或超聲聯合紫外處理后的香菇中多酚含量;C對照組為對照組的香菇中多酚含量。

1.2.6 紫外-可見光譜掃描 將按照方法1.2.2.1和1.2.3.1提取的PPO和POD進行凍干,然后分別溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0),配成濃度為1.0 mg/mL的酶溶液,在25 ℃的環境溫度下,采用紫外分光光度計在波長為190～400 nm的范圍內進行紫外-可見光譜掃描,掃描條件為:石英皿池長1.0 cm,掃描速度為60 nm/min,步長2.0 nm。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)的光譜為空白光譜,酶溶液的光譜與空白光譜的差譜,即為酶的紫外光譜。

1.2.7 紅外光譜掃描 將按照方法1.2.2.1和1.2.3.1提取的PPO和POD進行凍干,然后分別稱取20 mg于瑪瑙研缽中,加入150 mg KBr并磨成細粉,壓片,在波數4000～400 cm-1范圍、分辨率在2 cm-1的條件下掃描64次,并用KBr作為空白對照。數據經Omnic軟件轉換后,采用Peakfit對酰胺Ⅰ帶(1700～1600 cm-1)進行解卷積和分峰擬合,并對各歸屬峰進行二級結構指認。

1.2.8 X衍射光譜測定 將按照方法1.2.2.1和1.2.3.1提取的PPO和POD進行凍干,然后分別在玻璃樣品槽中壓平,X衍射掃描測定參數:管壓40 kV,Cu K射線(λ1=1.5406 ?,λ2=1.5444 ?,)掃描速度為2 °/min,掃描范圍2θ為3 °～80 °。

1.3 數據處理

每個試驗點重復3次,結果以平均值±標準差(Mean±SD)的形式表示。數據顯著性(P<0.05)分析采用SPSS 21.0,圖形的繪制采用Origin 8.5。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對鮮切香菇PPO與POD的酶活影響

超聲波、紫外線和超聲波聯合紫外線對鮮切香菇PPO與POD酶活、相對褐變度以及多酚相對含量的影響如圖1所示:

圖1 超聲波、紫外線和超聲波聯合紫外線對鮮切香菇PPO酶活、POD酶活、褐變度和多酚含量的影響

如圖1A所示:超聲波、紫外線、超聲波聯合紫外線處理均能鈍化鮮切香菇中的PPO與POD,其中單一超聲處理或超聲聯合紫外線處理對兩種酶的鈍化效果最佳,兩種處理無顯著性差異(P>0.05),單一紫外線對酶活的鈍化效果較差。經超聲波、紫外線、超聲聯合紫外線處理后,PPO相對酶活分別為30.6%、66.5%和31.0%,POD的相對酶活為44.3%、60.8%和46.2%。相比而言,PPO對紫外線或超聲波的敏感性較POD強。超聲波能夠鈍化酶活的原因在于香菇中的自由水在超聲波的空化作用下產生自由基,迫使蛋白質分子空間構象發生改變,從而發生酶活的變化[8]。酶的本質是蛋白質或者RNA,紫外線中的短波部分(波長100～280 nm)能夠使蛋白質分子失去生理活性或堿基突變,從而導致酶的失活[17]。

經超聲波、紫外線、超聲波聯合紫外線處理后,鮮切香菇都發生了不同程度的褐變(圖1B),其中單一紫外處理較其它兩種方式,相對褐變度更高,可能原因在于紫外照射后,香菇表面發生脫水,從而使得顏色加深。吳本剛[18]對胡蘿卜干燥的研究表明,胡蘿卜片表面顏色變化是由表層脫水干燥引起。超聲處理過程中產生的自由基可能將酚類物質氧化成醌類,從而加深顏色。張清安等[19]研究發現,黑米酒經超聲處理后,其顏色特性增加,而酚類物質含量與抗氧化活性下降。然而,超聲處理后,總多酚相對含量較高(圖1B),其根本原因在于,超聲能破壞細胞的結構組織[20],從而有利于多酚的溢出。單一紫外線處理、超聲聯合紫外處理,其相對多酚含量無顯著性差異(P>0.05),其原因可能在于:紫外處理后,細胞內多酚仍以結合態[21]形式存在;而超聲聯合紫外處理過程中,超聲可能破壞了香菇的表面結構,溢出的多酚在紫外線產生的活性氧的作用下發生了多酚氧化[22]。

2.2 PPO與POD的紫外-可見光譜分析

蛋白質的紫外吸收光譜與它的芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸密切相關,它可以用來表征蛋白結構的完整性,其中波長250～300 nm區域能夠提供蛋白質分子在溶液中的構象變化信息[23]。超聲波、紫外線和超聲波聯合紫外線對鮮切香菇PPO與POD的紫外光譜影響如圖2所示。

圖2 超聲波、紫外線和超聲波聯合紫外線對PPO與POD紫外光譜的影響

蛋白分子展開時,表面的生色團含量增加,從而引起紫外吸收強度增加[23]。PPO是一種酪氨酸酶,以無活性的前體形式存在。前體一般由富含羥基親水性氨基酸的N-端導肽、富含His殘基的中間高度保守的Cu結合區和疏水性C-端三部分組成,其中Cu結合區是該酶的主要功能區,其它部分則對酶的構象、高級結構的形成和維持起作用[24]。從圖2中可以看出,經超聲波、紫外線或超聲聯合紫外處理后,相同濃度下的酶分子的紫外吸光度增加,表明不同的處理暴露出了埋藏在C端的疏水性基團,導致酶的活性發生變化。

2.3 PPO與POD的紅外光譜及二級結構含量

傅里葉變換紅外光譜屬于分子振動光譜,可用來分析多肽和蛋白質的二級結構含量,并且不受樣品所處物理狀態的影響[25]。不同處理對鮮切香菇PPO與POD的紅外光譜的影響如圖3所示:

圖3 超聲波、紫外線和超聲波聯合紫外線對PPO與POD紅外光譜的影響

從圖3中可以看出,與對照組相比,經超聲處理的香菇,其POD在2930 cm-1處出現弱吸收峰,經紫外處理的PPO,尤其是經超聲聯合紫外處理的POD在3400 cm-1處的吸收峰展寬,其原因可能在于分子中氨基酸殘基上的羥基之間的氫鍵作用力增強[26],這也在一定程度上反應了疏水基團的暴露,促使分子趨于最低能級狀態。采用解卷積技術,利用PeakFit軟件對酰胺Ⅰ帶(1700～1600 cm-1)進行分峰、擬合,根據參考文獻[25,27-28]對各子峰歸屬進行二級結構指認、合并,其結果如表1:

表1 不同處理條件下PPO與POD的二級結構含量(%)

由表1可知,經紫外線或超聲聯合紫外處理,鮮切香菇中的POD的各二級結構含量變化不大。經單一超聲波處理后，POD中的α-螺旋和無規則卷曲含量明顯上升,分別增加了6.49%和12.16%,β-折疊和β-轉角含量分別減少了2.4%和10.60%;PPO中的α-螺旋和無規則卷曲含量分別增加了3.42%和6.94%,β-轉角下降6.33%。經單一紫外線處理后，PPO中的α-螺旋和無規則卷曲含量分別增加了4.11%和7.80%,β-折疊含量降了2.35%。超聲波聯合紫外線處理后,PPO中的α-螺旋和無規則卷曲含量分別增加了5.81%和9.93%,β-折疊含量減少了3.97%。綜上可知,POD與PPO失活的根本原因在于α-螺旋、無規則卷曲含量的上升和β-折疊含量的減少。劉野等[29]采用高壓CO2(30 MPa,60 min)處理PPO的結果也表明,PPO失活后,其α-螺旋和β-轉角含量升高,β-折疊含量降低。Subhedar等[30]采用超聲激活纖維素酶時,發現α-螺旋含量降低了12.38%、β-轉角含量上升了9.17%,酶的均一性和彈性減弱。然而,這與Yu等[31]研究發現剛好相反,可能在于研究的對象與作用方式的差異。

2.4 X衍射光譜分析

X衍射光譜能夠提供蛋白質的完整三維構象信息[32]。不同處理對鮮切香菇PPO與POD的XRD光譜的影響如圖4A、4B所示:

圖4 超聲波、紫外線和超聲波聯合紫外線對PPO與POD的XRD光譜的影響

如圖4所示:無論是PPO還是POD,經超聲處理后,其衍射峰的位置與對照組保持一致,表明超聲波處理后的PPO和POD三維構象可能保持不變,但峰強度發生了明顯的變化。紫外線處理后的PPO在2θ為10.5 °、16.7 °、19.0 °、26.5 °、27.2 °和39.8 °處出現了衍射峰,紫外線處理后的POD在2θ為24.2 °、25.5 °處的衍射峰消失或者強度明顯減弱,表明了紫外線處理后,PPO與POD的三維構象可能發生了改變。超聲波聯合紫外線處理后的PPO在2θ為20.8 °和29.4 °處分別出現了一個極強和中等強度的衍射峰,其余峰的位置基本與單獨紫外處理和單獨超聲處理保持一致。超聲波聯合紫外線處理后的POD在2θ為26.5°處極強的衍射峰,其余峰發生了消失。因此,可以推斷三維構象發生改變是酶活性變化的根本原因。Chen等[32]發現某些位置的衍射峰的消失或強度發生變化可以反映出蛋白質二級結構及其含量的變化。

3 結論

超聲波、紫外線、超聲波聯合紫外線處理均能鈍化鮮切香菇中PPO與POD的酶活,其中以超聲波或超聲波聯合紫外線處理的效果較佳。在超聲功率密度70 W/L、雙頻超聲20 kHz與40 kHz順序工作15 min后,PPO和POD相對酶活分別為30.6%和44.3%;紫外劑量為1.8 kJ/m2處理后,PPO和POD相對酶活分別為66.5%和60.8%;超聲聯合紫外處理后,PPO和POD相對酶活分別為31.0%和46.2%。紫外光譜、紅外光譜以及X衍射光譜表明:酶活發生改變的原因在于酶分子疏水性基團的暴露,α-螺旋、無規則卷曲含量的上升和β-折疊含量的減少,酶分子三維空間構象以及衍射峰強弱的變化。本研究僅考查了三種處理方式對引起褐變發生的主要酶的活性影響,后續尚需研究不同處理對鮮切香菇微生物含量與營養品質、包裝方式與儲藏過程中的生理特性變化以及貨架期等一系列問題。