益生菌發(fā)酵藍(lán)莓花色苷的代謝規(guī)律

陶 陽(yáng),廖小軍,韓永斌

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

益生菌是可定植于人體生殖系統(tǒng)或腸道,能產(chǎn)生明確健康功效、改善宿主微生態(tài)平衡和發(fā)揮有益作用的活性微生物[1]。通常消費(fèi)者攝入的每克產(chǎn)品中益生菌活菌數(shù)需超過(guò)107CFU[2]。此外,益生菌還能在人類胃腸道的條件下存活[1-2]。目前,主要從人類、動(dòng)物的糞便和發(fā)酵食品中分離益生菌[3]。雖然益生菌在市場(chǎng)上主要以發(fā)酵乳制品的形式出售,但乳制品中存在致敏原,導(dǎo)致部分消費(fèi)者無(wú)法放心食用,因此,近年來(lái)越來(lái)越多的研究者開(kāi)展了益生菌發(fā)酵非乳制品的相關(guān)研究[4]。果蔬汁含有微生物生長(zhǎng)所需的維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖等營(yíng)養(yǎng)素,因而被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)非乳制品益生菌飲料的理想基質(zhì)[5-6]。Xin等[7]研究了超高靜壓水處理的荔枝汁經(jīng)干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)發(fā)酵后制得的益生菌飲料的穩(wěn)定性,研究表明,此款益生菌飲料具有良好的色澤、風(fēng)味和接受度,且具有較高的總酚含量和抗氧化能力,在 4 ℃下可貯藏4周。Pimentel等[8]通過(guò)添加低聚果糖和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)對(duì)蘋果汁進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵蘋果汁的可接受度與純蘋果汁相似,但具有更高的酸度和渾濁度。Maryati 等[9]利用保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和兩岐雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)發(fā)酵西蘭花汁,結(jié)果表明,不同益生菌發(fā)酵西蘭花汁后其抗氧化活性、總酚含量和pH存在顯著差異(P<0.05)。

酚類物質(zhì)廣泛分布于各種果蔬中,是重要的功能性和風(fēng)味物質(zhì)。益生菌發(fā)酵果蔬的過(guò)程中,微生物的代謝活動(dòng)可產(chǎn)生酚酸脫羧酶、還原酶等酶,將酚酸轉(zhuǎn)化為一系列衍生物,對(duì)發(fā)酵果蔬制品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[10-11]。例如,植物乳桿菌可以將p-香豆酸、沒(méi)食子酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸轉(zhuǎn)化成重要的風(fēng)味物質(zhì),如 4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等,以及強(qiáng)抗氧化物質(zhì),如焦棓酸、二氫咖啡酸等,從而提高了發(fā)酵果蔬制品的風(fēng)味特征和營(yíng)養(yǎng)功能[12-14]。此外,益生菌發(fā)酵使酚酸類物質(zhì)發(fā)生脫羧和還原,進(jìn)而提高酚酸在人體內(nèi)的消化和吸收率[15]。此外,Markkinen等[16]選用植物乳桿菌對(duì)桑葚汁進(jìn)行發(fā)酵,植物乳桿菌發(fā)酵36 h后,復(fù)雜的結(jié)合酚轉(zhuǎn)化為游離酚,并通過(guò)多酚氧化酶使高分子量酚類化合物解聚,從而增加了DPPH自由基清除能力(增加 14.47%)。曹雪丹等[17]選用副干酪乳桿菌發(fā)酵甌柑汁10 d,甌柑汁內(nèi)總酚含量顯著升高(P<0.05)。Zhong等[18]采用植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁,發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)抗氧化能力的槲皮素和5-O-咖啡酰奎尼酸等酚類成分含量有所升高,因此發(fā)酵后DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均有顯著提高。綜上,采用益生菌發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化酚酸類物質(zhì)是增進(jìn)果蔬制品品質(zhì)和功能的重要手段,但目前益生菌發(fā)酵對(duì)花色苷類酚類物質(zhì)的代謝規(guī)律影響和作用機(jī)理尚不明確。

因此,本研究選取嗜熱鏈球菌、兩岐雙歧桿菌、植物乳桿菌三種益生菌,將藍(lán)莓花色苷提取物添加到培養(yǎng)液中,研究發(fā)酵過(guò)程中微生物的發(fā)酵特性以及花色苷的衍變,以期為益生菌發(fā)酵富含花色苷類果蔬制品的研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓(品種為“兔眼”) 江蘇省伊云貝爾有限公司;嗜熱鏈球菌CGMCC 1.8748、兩岐雙歧桿菌CGMCC 1.5090、植物乳桿菌BNCC 337796 中國(guó)微生物菌種保藏中心(北京);MRS肉湯培養(yǎng)基、PYG液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基 上海盛思生化科技有限公司。

MJ-BL25B2榨汁機(jī) 美的集團(tuán)股份有限公司;XOWX-100真空冷凍干燥機(jī) 南京先歐儀器制造有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海研承儀器有限公司;JA1003電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司;LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電氣有限公司;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;M1-16K臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司;LC-2010A液相色譜儀 日本島津公司;UV 5100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓渣花色苷提取液的制備 藍(lán)莓打漿后過(guò)濾收集藍(lán)莓渣,然后參考Khazaei等[19]方法提取花色苷,并稍加修改。在25 ℃室溫下,將藍(lán)莓渣和50%乙醇水溶液按料液比1∶15 g/mL混合,隨后于25 ℃、120 r/min條件下水浴振蕩浸提24 h,8000 r/min離心20 min后取上清液,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,制得花色苷粗提液,再用XAD-7HP大孔樹(shù)脂純化后,真空冷凍干燥48 h得藍(lán)莓花色苷粉末(冷凍干燥參數(shù)為:壓力0.0045 MPa、冷阱溫度(57 ℃)。

1.2.2 菌種預(yù)處理 菌種的活化參考Jeong等[20]的方法,并加以修改。用無(wú)菌吸管吸取300 μL液體培養(yǎng)基(植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌采用MRS肉湯培養(yǎng)基;兩岐雙歧桿菌采用PYG液體培養(yǎng)基),滴入安瓿管內(nèi),輕輕振蕩,使凍干菌粉呈懸浮狀態(tài)。吸取全部菌懸液,將其移入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。經(jīng)將活化后的菌液按1∶1 (V∶V)保存于50%甘油管中。

1.2.3 益生菌發(fā)酵 參考Oh等[21]的方法,并稍作修改。將配置好的液體培養(yǎng)基于121 ℃高溫滅菌20 min。將純化后的花色苷凍干粉復(fù)溶于無(wú)菌水中,使總花色苷濃度為2.5 g/L,然后在超凈臺(tái)內(nèi)采用無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。移取2 mL的花色苷溶液加入到培養(yǎng)液中,使花色苷總濃度達(dá)到100 mg/L,其后按2%的接種量分別接種活化后的嗜熱鏈球菌、兩岐雙歧桿菌和植物乳桿菌,使初始活菌數(shù)達(dá)到約7 lg CFU/mL。含兩岐雙歧桿菌的發(fā)酵液置于厭氧培養(yǎng)箱中,進(jìn)行嚴(yán)格的厭氧發(fā)酵,其余樣品置于恒溫培養(yǎng)箱中,37 ℃靜置發(fā)酵48 h,于發(fā)酵0、6、12、24、36、48 h后收集樣品進(jìn)行理化及微生物指標(biāo)分析。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.4.1 菌落總數(shù) 采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中三種益生菌的菌落總數(shù)[22]。其中MRS瓊脂培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌,BBL瓊脂培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)兩岐雙歧桿菌。

1.2.4.2 體外抗氧化能力 ABTS+·清除能力:參考He等[23]的研究。將2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)與過(guò)硫酸鉀分別用蒸餾水溶解后再混合,制成儲(chǔ)備液(終濃度為7、2.45 mmol/L),25 ℃下避光靜置16 h。測(cè)定時(shí),儲(chǔ)備液用0.2 mol/L,pH為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至734 nm處吸光值為0.70±0.02,將其作為測(cè)定液。取0.2 mL待測(cè)樣液與3.8 mL 測(cè)定液混合,30 ℃避光水浴靜置6 min后測(cè)定734 nm處的吸光值,根據(jù)ABTS+·抑制率,計(jì)算樣品的Trolox當(dāng)量(mmol Trolox/L)。

FRAP測(cè)定方法:參考He等[23]方法。以40 mmol/L的HCl溶液為溶劑,配制10 mmol/L的2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)溶液,用蒸餾水配制20 mmol/L的FeCl3溶液和0.3 mol/L、pH3.6的CH3COONa緩沖液,三者按體積比1∶1∶10混合,使用前于37 ℃避光水浴1 h,配制成TPTZ工作液。測(cè)定時(shí)取0.1 mL樣品、0.3 mL去離子水、3 mL TPTZ工作液于37 ℃水浴避光反應(yīng)6 min,測(cè)定593 nm處吸光值(mmol Fe2+/L)。

1.2.4.3 單體花色苷含量 單體花色苷含量的測(cè)定參考Cui等[24]方法,并稍加修改。樣品在13000 r/min、4 ℃離心10 min后過(guò)0.22 μm濾膜,進(jìn)行HPLC分析。HPLC測(cè)定參數(shù)如下:

色譜柱型號(hào):安捷倫 TC-C18柱(4.6×25 mm,5 μm);流動(dòng)相:A相為0.5%的三氟乙酸水溶液,B相為乙腈。梯度洗脫程序參數(shù)如下:0～5 min,10%～12% B;5～14 min,12%～13% B;14～16 min,13%～14% B;16～18 min,14%～16% B;18～19 min,16%～18% B;19～22 min,18%～22% B;22～35 min,22%～30% B;35～45 min,10%B。柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):520 nm;流速:0.8 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.4.4 酚酸含量 酚酸含量測(cè)定按照Z(yǔ)hu等[25]方法,并稍加修改。HPLC參數(shù)如下:

色譜柱:InertsilODS-3(4.6×250 mm,5 μm);柱溫:25 ℃,測(cè)定波長(zhǎng)為280 nm,進(jìn)樣量:20 μL。流動(dòng)相:A液:含1%醋酸的水溶液,B液:含1%醋酸的甲醇溶液,流速:0.6 mL/min,梯度程序按如下方式設(shè)定:0～10 min,10%～26% B;10～25 min,26%～40% B;25～45 min,40%～65% B;45～55 min,65%～95% B;55～58 min,95%～10% B;58～65 min,10% B。

1.2.4.5 有機(jī)酸含量 參考Lima等[26]方法,并稍加修改。HPLC方法如下:

色譜柱:安捷倫TC-C18柱(4.6×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃,測(cè)定波長(zhǎng)為210 nm,進(jìn)樣量:20 μL。流動(dòng)相:pH2.9的0.08 mol/L KH2PO4溶液進(jìn)行等梯度洗脫,流速:0.7 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果采用SAS 9.4做顯著性分析,顯著性檢驗(yàn)用LSD在P=0.05水平上進(jìn)行,Minitab 18統(tǒng)計(jì)軟件做主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中三種益生菌菌落總數(shù)變化

作為發(fā)酵過(guò)程中衡量各種微生物在體系中生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo),菌落總數(shù)可直觀反映出三種益生菌在含有花色苷的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)代謝情況。嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,ST)、兩岐雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum,SQ)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,LP)在添加藍(lán)莓花色苷的培養(yǎng)液中菌落總數(shù)變化如圖1所示。嗜熱鏈球菌、兩岐雙歧桿菌和植物乳桿菌初始濃度約為7.0 lg CFU/mL,三種益生菌數(shù)量均在發(fā)酵前12 h快速增加,隨后趨于穩(wěn)定。37 ℃發(fā)酵48 h后,添加藍(lán)莓花色苷的培養(yǎng)液中兩岐雙歧桿菌菌落總數(shù)最高,為8.19±0.10 lg CFU/mL,其次為嗜熱鏈球菌(8.02±0.11 lg CFU/mL)和植物乳桿菌(7.94±0.09 lg CFU/mL)。其中,發(fā)酵48 h后僅兩岐雙歧桿菌菌落總數(shù)和植物乳桿菌的菌落總數(shù)之間存在顯著性差異(P<0.05)。Li等[27]測(cè)定了藍(lán)莓花色苷提取物在體外模擬結(jié)腸發(fā)酵下對(duì)人體腸道菌群微生物的影響,結(jié)果表明其能促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。因此,雖然三種益生菌都能在添加花色苷的培養(yǎng)液中較好的生長(zhǎng),但兩岐雙歧桿菌可能是更適于藍(lán)莓渣花色苷培養(yǎng)基體系的益生菌種。

2.2 益生菌發(fā)酵前后發(fā)酵液體外抗氧化能力變化

漿果中抗氧化活性物質(zhì)主要為花色苷和其他酚類物質(zhì)[28]。通過(guò)測(cè)定含花色苷的培養(yǎng)液在發(fā)酵前后抗氧化能力的變化,可以反映出三種益生菌發(fā)酵過(guò)程對(duì)藍(lán)莓花色苷和其他酚類物質(zhì)生物活性的影響。在抗氧化能力體外測(cè)定方法中,選擇ABTS法測(cè)定發(fā)酵液的 ABTS+·清除能力,選擇FRAP法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)Fe3+的還原能力。

由從圖2可知,發(fā)酵前含藍(lán)莓花色苷的ST、SQ和LP培養(yǎng)液中ABTS+·清除能力分別為(61.91±6.83)、(63.11±6.19)、(63.23±6.02) mmol Trolox/L,Fe3+還原能力分別為(8.62±0.92)、(9.15±0.86)、(8.87±0.79) mmol Fe2+/L,三者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)三種益生菌發(fā)酵48 h后,各組發(fā)酵液ABTS+·清除能力均顯著提高(P<0.05)。其中兩岐雙歧桿菌發(fā)酵后增幅最大,為(49.06±2.26) mmol Trolox/L,其次為植物乳桿菌發(fā)酵(38.22±1.18 mmol Trolox/L)和嗜熱鏈球菌(29.74±9.16 mmol Trolox/L)發(fā)酵(P<0.05)。Li等[29]用植物乳桿菌發(fā)酵富含酚類物質(zhì)的蘋果汁,發(fā)現(xiàn)其DPPH和ABTS+·清除能力在發(fā)酵后也顯著性提高(P<0.05)。Kwaw等[30]選用不同的乳桿菌發(fā)酵桑葚汁也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樵谝嫔l(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)了酚類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化,將部分酚類成分轉(zhuǎn)化成了抗氧化能力更高的衍生物[31]。Alicia等[32]就指出一些微生物如芽孢桿菌可以將阿魏酸或?qū)ο愣顾徂D(zhuǎn)化為香蘭素或4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。一方面,益生菌發(fā)酵提高植物組分抗氧化活性的過(guò)程也受到pH、溫度、發(fā)酵時(shí)間、微生物種類等多種條件的影響[33],因此,三種益生菌發(fā)酵的培養(yǎng)液抗氧化能力差異可能源于微生物自身代謝酚類物質(zhì)的方式和機(jī)制不同[34];另一方面,兩岐雙歧桿菌發(fā)酵后的培養(yǎng)液Fe3+還原能力顯著提高(P<0.05),植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵前后均無(wú)顯著差異(P>0.05)。這可能是由于不同測(cè)定方法考察的能力有所不同,ABTS法主要是考察樣品中的成分對(duì)自由基的清除能力,而FRAP法主要考察樣品中組分的還原能力[35]。因此,益生菌發(fā)酵可能只提升了含藍(lán)莓花色苷培養(yǎng)液的自由基清除能力。

圖2 不同益生菌發(fā)酵前后發(fā)酵液體外抗氧化能力變化

2.3 益生菌發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化

益生菌發(fā)酵含藍(lán)莓花色苷培養(yǎng)液過(guò)程中有機(jī)酸含量變化如圖3所示。發(fā)酵過(guò)程中鑒定到的有機(jī)酸主要為乳酸和丙酮酸。其中,乳酸的含量先上升后趨于穩(wěn)定,丙酮酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵48 h后,植物乳桿菌發(fā)酵的培養(yǎng)液中乳酸含量最高(2007.77±350.18 mg/L),其次是嗜熱鏈球菌(1546.83±348.18 mg/L)和兩岐雙歧桿菌(914.89±116.18 mg/L)發(fā)酵的樣品。兩岐雙歧桿菌產(chǎn)乳酸的能力弱于植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌,這可能與三株益生菌自身代謝差異有關(guān),植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的主要發(fā)酵途徑為利用發(fā)酵體系中的碳源和氮源進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵,其發(fā)酵的產(chǎn)物主要為乳酸,而兩岐雙歧桿菌則主要進(jìn)行異性乳酸發(fā)酵,其發(fā)酵產(chǎn)物除乳酸外,還有乙醇和乙酸等[36]。

圖3 不同益生菌發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化

2.4 益生菌發(fā)酵過(guò)程中單體花色苷的變化

主成分分析可將多變量的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理,提取其中主要的特征進(jìn)行線性分析。因此為了進(jìn)一步闡明嗜熱鏈球菌、兩岐雙歧桿菌、植物乳桿菌在含藍(lán)莓花色苷培養(yǎng)液體系發(fā)酵過(guò)程中單體花色苷種類以及其含量的變化情況,采用主成分分析法(PCA)對(duì)發(fā)酵48 h內(nèi)不同樣品進(jìn)行分析,分析結(jié)果如圖4所示。其中第一分量(PC1)和第二分量(PC2)累計(jì)解釋數(shù)據(jù)差異的91.8%,可以綜合六項(xiàng)指標(biāo)的大部分信息。另外,表2為不同發(fā)酵階段發(fā)酵液中花色苷的含量。

表2 益生菌發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液中花色苷含量變化

圖4 益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液中單體花色苷的主成分分析圖(A)和載荷圖(B)

由圖4A可知,添加藍(lán)莓花色苷的發(fā)酵樣品在PC1上的分值隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸降低,表明益生菌發(fā)酵可顯著改變培養(yǎng)液中花色苷的組成。其中未發(fā)酵樣品和發(fā)酵12 h內(nèi)的植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌樣品分布于PC1的正向區(qū)間內(nèi),而發(fā)酵24 h后的樣品則主要分布于PC1的負(fù)向區(qū)間內(nèi)。單體花色苷的載荷圖中包括六種單體花色苷——飛燕草-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷和錦葵素-3-阿拉伯苷,均分布在PC1的正區(qū)間,因此可以判斷發(fā)酵過(guò)程中六種單體花色苷的含量均有不同程度的下降,表明所選擇的三株益生菌均能不同程度的代謝藍(lán)莓花色苷。以植物乳桿菌的發(fā)酵樣品為例,發(fā)酵48 h后飛燕草-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷和錦葵素-3-阿拉伯苷的含量分別下降了(71.24±5.30)、(11.41±2.05)、(15.30±2.29)、(7.89±0.57)、(11.57±1.37)和(18.19±3.14) mg/L。此外,從圖4還可看出隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),不同發(fā)酵樣品朝PC1負(fù)區(qū)間移動(dòng)的幅度下降,表明發(fā)酵后期單體花色苷的下降幅度有所降低,這可能是由于三株益生菌在發(fā)酵過(guò)程中將花色苷轉(zhuǎn)化為小分子的酚酸并產(chǎn)生了有機(jī)酸[33],降低了培養(yǎng)基中的pH,從而減緩了花色苷的降解。

從圖4A還可以看出,不同益生菌株發(fā)酵的樣品在單體花色苷組分方面存在一定差異。兩岐雙歧桿菌發(fā)酵的樣品主要存在于PC2的負(fù)向區(qū)間,而植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵的樣品主要存在于PC2的正向區(qū)間。結(jié)合圖4B可發(fā)現(xiàn)三株益生菌對(duì)花色苷的代謝差異主要來(lái)自于錦葵素-3-半乳糖苷和錦葵素-3-葡萄糖苷含量的差異。植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和兩岐雙歧桿菌在發(fā)酵48 h后錦葵素-3-半乳糖苷分別降解了(11.57±1.37)、(10.44±2.24)和(10.90±0.83) mg/L,錦葵素-3-葡萄糖苷分別下降了(7.89±0.57)、(10.13±1.17)和(5.04±0.59) mg/L。Otieno等[37]指出益生菌所具有的α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶在異黃酮糖苷的水解中至關(guān)重要,但不同菌株水解糖苷的能力有所差異,這可能是導(dǎo)致三株益生菌對(duì)花色苷的代謝能力有差異的原因。

2.5 益生菌發(fā)酵過(guò)程中酚酸的變化

酚酸的組成和含量也是反映花色苷體系代謝的重要指標(biāo),因?yàn)橐嫔任⑸锟梢詫⒉糠只ㄉ誃環(huán)C3的糖苷鍵脫甲基化,從而形成小分子的酚酸[38]。三株益生菌發(fā)酵含藍(lán)莓花色苷培養(yǎng)基過(guò)程中酚類物質(zhì)含量變化的主成分分析如圖5所示。同時(shí),發(fā)酵不同階段酚酸含量見(jiàn)表3。主成分的第一分量和第二分量可累計(jì)解釋數(shù)據(jù)差異的74.2%。由圖5A可知,三株益生菌發(fā)酵的樣品PC1值均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。發(fā)酵前,樣品主要分布于PC1的正向區(qū)間內(nèi),發(fā)酵48 h后三株發(fā)酵樣品均分布于PC1的負(fù)向區(qū)間內(nèi),表明培養(yǎng)液中酚酸組成發(fā)生了顯著變化。而載荷圖中僅有綠原酸、對(duì)香豆酸和咖啡酸位于PC1的正向區(qū)間內(nèi),沒(méi)食子酸、丁香酸和阿魏酸均分布于PC1的負(fù)向區(qū)間,這表明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),三株益生菌發(fā)酵樣中綠原酸、對(duì)香豆酸和咖啡酸的含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),而沒(méi)食子酸、丁香酸和阿魏酸含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。此外,同一發(fā)酵時(shí)間內(nèi),三株益生菌發(fā)酵的樣品分布差異較大,兩岐雙歧桿菌的發(fā)酵樣主要分布于PC2的正向區(qū)間內(nèi),而嗜熱鏈球菌的發(fā)酵樣則主要分布于PC2的負(fù)向區(qū)間內(nèi),結(jié)合載荷圖可知這種差距主要來(lái)自于沒(méi)食子酸、阿魏酸和咖啡酸含量的差異。例如,在發(fā)酵第48 h時(shí),兩岐雙歧桿菌發(fā)酵樣中沒(méi)食子酸和阿魏酸的含量比發(fā)酵前上升了(8.74±2.99)和(1.75±0.22) mg/L,咖啡酸比發(fā)酵前下降了(0.71±0.12) mg/L,但在嗜熱鏈球菌的發(fā)酵樣中沒(méi)食子酸和阿魏酸的含量?jī)H比發(fā)酵前上升了(5.79±5.08)和(1.66±0.34) mg/L,咖啡酸下降了(0.15±0.18) mg/L。其中,阿魏酸可以通過(guò)矢車菊-3-葡萄糖苷中B/C環(huán)的斷裂形成,而沒(méi)食子酸和丁香酸等酚酸主要為錦葵素類花色苷的降解產(chǎn)物[39]。此外,乳酸菌還可以將綠原酸分解為咖啡酸,并被酚酸脫羧酶和還原酶進(jìn)一步代謝為二氫咖啡酸、乙基兒茶酚和乙烯基兒茶酚等衍生物[40-41]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),分值圖中不同菌株發(fā)酵樣朝PC1負(fù)方向移動(dòng)的幅度變緩,這可能是由于益生菌中負(fù)責(zé)花色苷降解的酶需要由花色苷誘導(dǎo),而發(fā)酵后期樣品中花色苷的濃度較低,降解花色苷的酶活力較弱,因而酚酸的變化趨于緩慢[42]。通過(guò)以上花色苷和酚酸的代謝規(guī)律,可為進(jìn)一步研究益生菌發(fā)酵果蔬體系功能性物質(zhì)的衍變提供理論依據(jù)。

表3 益生菌發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液中酚酸含量變化

圖5 益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液中酚酸的主成分分析圖(A)和載荷圖(B)

3 結(jié)論

本研究選用植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和兩岐雙歧桿菌對(duì)添加藍(lán)莓花色苷的培養(yǎng)液進(jìn)行48 h的發(fā)酵。發(fā)酵后三株益生菌的活菌數(shù)均增至8.0 lg CFU/mL,達(dá)到益生菌攝入標(biāo)準(zhǔn)。相比嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌,兩岐雙歧桿菌更適于在添加了藍(lán)莓花色苷的環(huán)境中生長(zhǎng)。對(duì)比發(fā)酵前后樣品的抗氧化能力,三株益生菌發(fā)酵樣的ABTS+·清除能力均顯著提升(P<0.05),其中兩岐雙歧桿菌發(fā)酵樣增幅最大(P<0.05),但Fe3+還原能力無(wú)顯著變化(P>0.05)。發(fā)酵過(guò)程中,乳酸呈增加趨勢(shì),而丙酮酸呈先上升后下降的趨勢(shì),其中植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的乳酸產(chǎn)量顯著高于兩岐雙歧桿菌(P<0.05)。六種單體花色苷經(jīng)發(fā)酵后均有不同程度的損失,主成分分析表明三株益生菌對(duì)花色苷代謝的差異主要來(lái)自于對(duì)錦葵素-3-半乳糖苷和錦葵素-3-葡萄糖苷的降解差異。分析酚酸組分發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過(guò)程中綠原酸、對(duì)香豆酸和咖啡酸的含量總體呈減少趨勢(shì),而沒(méi)食子酸、丁香酸和阿魏酸的含量總體呈增加趨勢(shì),不同菌株對(duì)酚酸的代謝差異主要來(lái)自于對(duì)沒(méi)食子酸、阿魏酸和咖啡酸轉(zhuǎn)化的差異。綜上所述,三株益生菌均能代謝花色苷和轉(zhuǎn)化酚類物質(zhì),但兩岐雙歧桿菌更適于發(fā)酵含花色苷等酚類物質(zhì)的體系,該結(jié)果可為益生菌發(fā)酵花色苷類果蔬汁提供理論依據(jù)。