在線能量分辨質譜結合量子化學計算分析山奈素的多級質譜行為

管朋維 宋青青 張 珂 李 婷 李 瑋 屠鵬飛 李 軍,2 宋月林*,2

(北京中醫藥大學 中藥學院中藥現代研究中心1，中藥品質評價北京市重點實驗室2，北京 100029)

1 引 言

能量分辨質譜法(Collision energy-resolved mass spectrometry，ER-MS)是一種通過改變碰撞能量實現母離子內能的改變，依據不同內能的母離子碰撞活化分解的子離子豐度隨能量變化方式研究碰撞活化的機理、能量沉積模式的質譜方法[1]。隨著串聯質譜的快速發展，通過ER-MS獲得目標母離子的裂解曲線(Breakdown graph)，已廣泛應用于同分異構體的區分[2～5]。本研究組前期在ER-MS的基礎上發展了一種新型的在線能量分辨質譜法(Online ER-MS，又稱在線碰撞能優化策略)，可以利用高效液相色譜(HPLC)一次進樣(必要時可調整為2～3次進樣)，獲得目標子離子在不同碰撞能下的響應值，進而構建裂解曲線，進一步通過高斯曲線擬合，獲得目標子離子的最佳碰撞能(Optimal collision energy，OCE)[6～15]。對于HPLC串聯三重四極桿質譜(QqQ-MS)，Online ER-MS測定的是母離子/子離子的峰面積，精密度高于測定峰強度的傳統能量分辨質譜。并且，通過Online ER-MS獲得的OCE與產生目標子離子的化學鍵裂解能正相關，與鍵長負相關，但與液相色譜條件及離子源參數無關。由于同分異構體的化學鍵性質常存在差異，OCE結合量子化學計算已被用于同分異構體的區分，實現化學結構的準確鑒定[16,17]。然而，Online ER-MS尚未被用于深入探討化合物質譜行為。

黃酮是天然產物中最大的化學類型之一，廣泛分布于水果、蔬菜等各類植物中，也是諸多重要中草藥如黃芩、黃芪、甘草、銀杏葉等的有效成分[18～21]。目前報道的黃酮類化合物數以千計，該類化合物的多級質譜行為已被廣泛研究[22,23]。除黃酮寡聚體等少數幾種結構亞型外，主要的裂解方式包括H2O中性丟失、CO中性丟失、C環的Retro-Diels-Alder裂解(RDA裂解)、雜環裂解(Heterocyclic ring fission，HRF)、B環中性丟失等。如果具有甲氧基、異戊烯基、糖基取代，尚可見甲基自由基(CH3·)丟失、糖殘基中性丟失、丁烯(C4H8)中性丟失等。為了方便描述子離子， Ma等[24]對常見的碎片離子進行了命名。Abliz研究組在對黃酮苷類化合物的質譜行為進行深入分析時發現，[Y0]-和[Y0-H]-·，甚至是[Y0-2H]-，可作為診斷離子，并利用它們的相對響應值對糖苷化位點進行區分[25,26]。由于子離子的峰高決定于化學鍵本身的性質與碰撞能的大小[17]，因此，該研究組的工作提示可以利用ER-MS對黃酮類化學成分的多級質譜行為進行深入分析。

為了更深入、高效地研究黃酮類化學成分的多級質譜裂解過程，本研究以常見的黃酮類化合物山奈素為例，利用本課題組前期建立的Online ER-MS探討特征性碎片離子的形成過程，以期為現有黃酮類質譜裂解規律提供補充數據，形成更完善的質譜裂解規律，為中草藥、果實、蔬菜等復雜基質中黃酮類化學成分的快速結構鑒定提供有益參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

島津分析型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，配兩個LC-20ADXR泵、DGU-20A真空脫氣機、SIL-20AD自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱; IT-TOF質譜儀(日本Shimadzu公司)、SCIEX Qtrap5500質譜儀(美國SCIEX公司); XS105型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司); Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司); XW-80A漩渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。色譜純甲醇、質譜純甲酸和乙腈(美國Thermo Fisher公司); 實驗用水為Milli-Q純水系統制備的超純水。對照品山奈素(Kaempferide)購于上海詩丹德生物科技有限公司，經HPLC-DAD檢測，純度>98%。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準溶液的配制準確稱取適量對照品，用二甲基亞砜(DMSO)配成10.0 mg/mL的標準品儲備液。吸取適量標準品儲備液，用50%甲醇逐步稀釋并渦旋1 min,充分混勻，最終得到1.0 μg/mL的工作溶液。

2.2.2 液相色譜條件反相色譜柱: Waters Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，80% B以0.2 mL/min洗脫5 min。柱溫35℃，進樣量2 μL。

2.2.3 IT-TOF-MS條件電噴霧離子源(ESI)，掃描模式: 正離子模式并自動觸發多級質譜，MS1的質量掃描范圍為m/z100～1000; MS2的質量掃描范圍為m/z50～1000，碰撞誘導解離(CID)能量為70%。噴霧室電壓為3.5 kV; 霧化氣(N2)流量為1.5 L/min; 干燥氣體壓力為100 MPa; 檢測電壓為1.6 kV; 曲型脫溶劑管(CDL)和加熱模塊溫度均為200℃。碰撞室壓力為2.0×10-4Pa; 離子肼壓力為3.0×10-2Pa; 各級質譜的重復次數為3，離子累積時間為10 ms。高分辨質譜數據采用LCMS solution軟件進行處理，并利用Calculator程序計算元素組成，誤差限度為20 mDa。

2.2.4 Online ER-MS條件SCIEX Qtrap5500，電噴霧離子源(ESI)，正離子多反應監測模式。氣簾氣: 35.0 psi (1 psi=6.89 kPa); 碰撞氣: 高; 噴霧電壓: 5500 V; 霧化氣: 55 psi; 輔助氣: 55 psi; 霧化溫度: 550℃; 脫離子簇電壓(DP): 100 V; Q1和Q3均為單位分辨率(0.6～0.8 Da)。參照本研究組前期工作[16,17]，進行Online ER-MS測定。由于在IT-TOF-MS中，母離子m/z301.0712([M+H]+)產生的子離子主要包括m/z286.0518、272.0454、165.0155、161.0573、153.0192和139.0381。除m/z161.0573，其它子離子均可通過高分辨質譜信息及已報道的裂解途徑歸屬其來源。因此，構建目標離子對m/z301>161，進一步派生出一組擬離子對(Pseudo-ion transitions, PITs)，對應一組10～90 eV范圍內以1 eV遞進的碰撞能。PITs為m/z301.000>161.000、 301.001>161.000、 301.002>161.000, 直至m/z301.090>161.000，對應的碰撞能分別為10、11、12 eV, 直至90 eV。每個PIT的采集時間(Dwell time)為10 ms

利用Analyst 1.6.2軟件對色譜峰進行積分，參數為默認設定。定義最大的PIT峰面積為1，其它峰面積均進行標準化，轉化成相對峰面積值，形成獨立數據集。將數據集導入GraphPad Prism 7.0 軟件(San Diego, CA)繪制裂解曲線，采用兩條高斯曲線進行擬合，通過回歸方程分別計算OCE值。

2.2.5 化學結構計算在ChemDraw 14.0 (美國CambridgeSoft公司)程序中構建山奈素的分子結構模型，在Chem3D中打開所建立的分子模型，先用SYBYL-X 2.0軟件包(英國Tripos公司)進行初步的幾何構型優化，再在DFT/B3LYP/6-31G(d, p)基組下進行幾何全優化，并計算其結構參數。密度泛涵理論考慮了電子相關能，因此，在DFT/B3LYP/6-31G(d, p)基組下對山奈素及推測的碎片結構進行能量計算，計算程序采用Gaussian 09W(Gaussian, Inc.)[27]。

3 結果與討論

3.1 高分辨多級質譜行為

圖1 山奈素的高分辨MS1(A)和MS2(B)圖譜Fig.1 High resolution MS1 (A) and MS2 (B) spectra of kaempferide

圖2 山奈素主要碎片離子質譜裂解途徑歸屬Fig.2 Fragmentation pathways of kaempferide by mass spectrometry

山奈素(C16H12O6)為典型的黃酮醇類化合物，3、5、7位均具有羥基取代，4′位具有甲氧基取代。比較山奈素在正、負離子模式下的多級質譜圖發現, 正離子模式能夠產生更豐富的碎片離子[22]。在MS1圖譜(圖 1A)中，主要的質譜信號為m/z301.0712([M+H]+, C16H13O6+, error: 0.5 mDa); 在MS2圖譜(圖 1B)中，主要的質譜信號包括m/z286.0518 (C15H10O6+·, error: -3.2 mDa), 272.0454 (C15H12O5+·, error: 1.4 mDa), 165.0155 (C9H9O3+, error: -1.4 mDa), 161. 0573 (C9H5O3+, error: -34.0 mDa, 153.0192 (C7H5O4+, error: 3.7 mDa)和139.0381 (C7H7O3+, error: -0.9 mDa)。結合計算的元素組成及前人推導的質譜裂解途徑[22]，初步歸屬各子離子的來源。m/z286由母離子失去甲基自由基(CH3·)形成，m/z272為失去CHO·自由基的產物，m/z165為0,3B+，而m/z153和139分別對應1,3A+和0,3A+。對于m/z161離子，其可能為1,4B+中性丟失CH4的產物，也有可能由0,4B+中性丟失CH3OH生成。 推斷的山奈素質譜裂解途徑見圖2。

3.2 在線能量分辨質譜

為了確切歸屬m/z161的生成過程，引入Online ER-MS。通過構建母離子>子離子對(m/z301>161)，進一步衍生出PITs(m/z301.000>161.000、 301.001>161.000、 301.002>161.000等)，并對應以1 eV梯度變化的碰撞能(10～90 eV)。在QqQ-MS平臺上， 采用多反應監測模式獲得每個PIT的峰面積，歸一化處理后繪制裂解曲線。如圖3所示，裂解曲線出現兩個波峰，以48 eV為分界點，曲線的前半部分和后半部分均能與高斯曲線較好地吻合(圖3)，表明子離子m/z161.0573可以通過兩條獨立的裂解途徑產生，通過回歸曲線方程計算最佳碰撞能分別為38.87和60.55 eV。

圖3 離子對m/z 301>161的裂解曲線Fig.3 Breakdown graph for ion transition m/z 301>161

3.3 結構及能量計算

理論上，碎片離子(本研究表現為離子對)的最佳碰撞能應與涉及到的化學鍵裂解能成正比，而裂解能一般通過母離子和碎片(包括子離子、中性分子、自由基等)能量差值體現[16,28]。為了更深入解析裂解途徑，采用Gaussian軟件對山奈素的母離子([M+H]+)及推導的碎片結構進行相關的能量計算，尋找母離子和碎片結構的能量差值與最佳碰撞能的關系，并分別歸屬m/z301>161裂解曲線雙峰的來源。根據鍵能計算公式ΔE=EAB-(EA+EB)[29]，計算化學鍵裂解能。EAB為母離子能量，EA為子離子能量，EB為碎片能量，母離子與子離子及碎片之間的能量差值ΔE為斷裂化學鍵的鍵能。經計算，山奈素的母離子([M+H]+)的能量為690.2 kJ/mol，部分結構碎片的計算結果如表1所示。

表1 山奈素部分結構碎片的能量計算結果

對于m/z301>161而言，其可能對應兩種不同的裂解方式(圖2)。其中，C環RDA裂解斷裂0,4鍵，繼而中性丟失CH3OH對應的裂解能為-32.00 kJ/mol; C環雜環裂解斷裂1,4鍵，繼而中性丟失CH4對應的裂解能為-24.50 kJ/mol。兩種裂解方式的裂解能存在顯著差異，而m/z301>161的裂解曲線正好表現為“M”型。因此，推斷“M”型裂解曲線的前半部分對應的裂解途徑為C環雜環裂解斷裂1,4鍵，繼而中性丟失CH4，而后半部分對應C環RDA裂解斷裂0,4鍵，繼而中性丟失CH3OH。

本研究首次報道了“M”型裂解曲線，結合本課題組前期在雙咖啡酰基奎尼酸(如異綠原酸A、B和C)的質譜規律研究中也觀察到“M”型裂解曲線(待發表)，該現象可能為多來源子離子的普遍現象。但是， 只有當兩種裂解方式對應的OCE值差異較大時，方能出現較為明顯的“M”型裂解曲線。兩種裂解方式的OCE值完全一致的情況下，多來源子離子的裂解曲線也表現為高斯曲線。

特征離子的豐度或者豐度比[25,26]常被用于同分異構體的快速區分。然而，不同的儀器平臺采集的質譜圖存在較大差異，甚至同一臺儀器在不同時間質譜圖也存在差異，使得這些規律的適用性大打折扣。而本研究組前期發現, 裂解曲線是化合物的固有性質，除了碰撞氣體之外，與其它實驗條件無顯著性關系[17]，因而，Online ER-MS可以成為研究化合物多級質譜行為以及區分同分異構體的有效方法。

4 結 論

本研究利用LC-IT-TOF-MS和LC-QqQ-MS兩種質譜平臺，并結合Online ER-MS和量子化學計算對山奈素的多級質譜行為進行了深入分析。通過LC-IT-TOF-MS提供的高分辨多級質譜數據，結合前人對山奈酚(4′位為羥基)質譜行為的研究[30]，初步推斷山奈素存在0→3、0→4、1→3、1→4、2→3等裂解方式，其主要的質譜裂解途徑包括C環的RDA裂解、雜環裂解、甲基自由基丟失、CH4中性丟失和CH3OH中性丟失。在LC-QqQ-MS上運行Online ER-MS，發現子離子m/z161對應的裂解曲線呈“M”型，表明m/z161.0573有兩種生成方式。結合結構計算，分析“M”型裂解曲線的第一波峰由低裂解能的C環雜環裂解斷裂1,4鍵繼而中性丟失CH4產生，第二波峰由高裂解能的C環RDA裂解斷裂0,4鍵繼而中性丟失CH3OH產生。因此，通過Online ER-MS與量子化學計算的結合可以對化合物的多級質譜行為進行深入分析。本研究結果可為黃酮類化學成分的快速結構鑒定提供參考。