谷胱甘肽的寬頻太赫茲光譜研究

2020-10-22 02:27:52朱中杰沈建雄張宗昌張建兵趙德明趙紅衛

分析化學 2020年10期

郭聰朱中杰沈建雄張宗昌張建兵趙德明趙紅衛*

1(浙江工業大學化工學院，杭州 310014) 2(中國科學院上海高等研究院張江實驗室，上海 201210) 3(中國科學院上海應用物理研究所，上海201800)

1 引言

太赫茲時域光譜(THz-TDS)是基于飛秒激光技術發展起來的一種新型光譜技術，其信噪比高，可有效探測分子低頻振動、分子間弱相互作用以及晶格振動等[11～13]。太赫茲波能量低，不會對生物分子造成電離損傷，被廣泛應用于生物分子如核酸和蛋白質等的結構分析以及分子相互識別的研究[14～16]。Nibali等[17]利用分子動力學模擬酪氨酸磷酸酶PDZ結構域的變構過程和酶與RAGEF2短肽形成復合物前后的太赫茲光譜，結果表明，配體的親和力和結合模式能調節PDZ結構域的變化，使蛋白質功能改變，并引起不同的太赫茲共振響應。蛋白質的生物學功能與其構象的多樣性和復雜性有關，而蛋白質中肽鏈以及氨基酸單元通過非共價鍵影響蛋白質的構型構象，因此多肽構型構象的研究至關重要。Yamamoto等[18]采用光電導THz-TDS研究GSSG，結果表明，GSSG對太赫茲波呈無特征吸收。Rutz[19]和Wang[20]等利用光電導天線THz-TDS對GSH進行測量，分別獲得了室溫下0.12～2.0 THz和0.3～2.4 THz波段的吸收光譜，并利用單分子模擬對光譜進行分析。由于該理論模擬方法未考慮分子間的相互作用，導致實驗光譜與理論光譜的吸收峰位移不完全吻合。GSH和GSSG的寬頻太赫茲光譜有助于加深了解分子的振動性質以及具有生物學活性的分子構型構象變化特點。本研究采用空氣等離子體寬頻THz-TDS系統對GSH和GSSG進行探測，在室溫條件下獲得0.5～12.0 THz波段的光譜信號。利用密度泛函漸論(DFT)對GSH在太赫茲波段吸收光譜進行理論計算和振動模式分析，深入了解氫鍵對GSH分子的構型構象和排列方式的影響機制。GSH有多種晶型結構[21～24]，考慮到不同晶型結構對太赫茲響應的差異，本研究采用粉末X射線衍射(PXRD)對樣品晶型進行測量表征。

圖1 (A)還原型和(B)氧化型谷胱甘肽的分子結構Fig.1 Molecular structures of (A) reduced glutathione (GSH) and (B) oxidized glutathione (GSSG)

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

基于空氣等離子體的TA-800寬頻太赫茲光譜儀(Terahertz Photonics公司)，用于探測樣品0.5～12.0 THz范圍內的太赫茲吸收光譜。采用摻鈦藍寶石激光放大系統(美國 Spectra-Physics公司， Spitfire Ace)作為光源，入射激光的中心波長為800 nm，脈沖寬度小于35 fs，重復頻率為1 kHz，用于激發太赫茲的泵浦脈沖能量約為0.9 mJ，檢測的脈沖能量約為80 μJ，偏置相電壓為1.5 kV。利用基于光電導開關8-F共焦THz-TDS系統(自建)測量樣品0.2～2.8 THz范圍的太赫茲吸收光譜，采用摻鈦藍寶石激光系統(美國 Spectra-Physics公司, Mai Tai)作為光源，入射激光的中心波長為800 nm。兩套TDS系統的信噪比均大于1000∶1。采用X射線多晶衍射儀(德國 Bruker公司)探測樣品在10°～90°范圍內的PXRD衍射圖。

GSSG和GSH(純度98%，百靈威化學技術有限公司); 襯底材料為環烯烴共聚物(COC，上海原子核研究加工廠)，粒徑小于100 μm，此襯底材料在13 THz以下的吸收對樣品測量的影響可以忽略[25]。

2.2 實驗方法

2.2.1 THz-TDS測量樣品制備襯底與被測樣品以合適比例在研缽中充分混合均勻后，用壓片機在2 MPa的壓力下將粉末壓成直徑13 mm、厚度0.7 mm的樣片。

太赫茲光譜的探測飛秒光被分束片分為兩束，光束經透鏡和BBO倍頻晶體作用產生二次諧波脈沖后與基頻光束在空氣中聚焦，聚焦區的空氣產生等離子體進而輻射出寬帶太赫茲激光脈沖[26]。太赫茲激光脈沖經分束鏡分為泵浦光和探測光。兩束光在樣品中共線聚焦，產生新的二次諧波脈沖。用光電倍增管(PMT)探測經400 nm帶通濾波器篩選出帶有樣品信號的二次諧波脈沖。太赫茲場振幅與該諧波光束能量的平方根成正比，因此，可以將PMT測得信號進行處理以獲得太赫茲信號[27]。探測光焦點處的電極引入外部偏置電壓，用于相干檢測。

2.2.2 PXRD實驗PXRD實驗采用X射線源為銅靶，工作電壓為40 kV，工作電流為40 mA，掃描速度0.2°/s，掃描范圍為10°～90°(2θ)。

2.3 參數計算

太赫茲時域光譜采集的信號是包含樣品相位和幅值信息在內的單位脈沖的時域信號。該信號經過傅立葉變換可以獲得樣品的折射率、介電常數和吸收系數。實驗測得以空氣為參考背景的信號Pref(ω)和樣品信號Psan(ω)。兩個信號通過快速傅立葉變換，時域信號轉換成為對應的頻域信號，具體變換公式如下：

(1)

其中，TLinear(ω)為透過率(%)，Psan(ω)為樣品的電場能量光譜，Pref(ω)為樣品背景的能量光譜：

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

其中，α(ω)是吸收系數(cm-1)，k(ω)為消光系數，ω為角頻率(rad/s);c為光速(m/s)。

3 量子化學計算

考慮到本研究是在室溫下探測GSH的太赫茲吸收光譜，且利用PXRD測量所獲的GSH衍射譜與文獻中295 K溫度[24]下測量結果一致，因此選用295 K溫度下的晶胞參數(斜方晶系，空間群P212121，a=5.6216(4)，b=8.7855(6)，c=28.0552(18)?)為理論計算初始值，進行分子的結構優化和太赫茲光譜計算及振動分析。本研究采用Materials Studio中以密度泛函理論(DFT)為基礎的CASTEP模塊進行量子化學計算，平面波截止能量為600 eV。選擇廣義梯度近似的Perdew-Burke-Ernzerhof(GGA-PBE)作為電子與電子交互和相關效應的計算，并采用Grimme下用色散修正項校正PBE泛函的PBE-D2方法[28]; 利用4×2×1 Monkhorst-Pack K點網格進行幾何優化和太赫茲理論光譜計算。

圖2 利用空氣等離子體寬頻太赫茲系統獲得的0.5～12.0 THz 范圍內GSH和GSSG太赫茲吸收光譜，插圖為利用光電導開關8-F共焦太赫茲系統(系統Ⅱ)獲得的0.2～2.8 THz 范圍內GSH和GSSG太赫茲吸收光譜(圖中陰影部分僅供參考)Fig.2 Terahertz absorption spectra of GSH and GSSG in the range of 0.5-12.0 THz obtained by the broadband air plasma terahertz system.Spectra in inset are obtained by the photoconductive switch 8-F confocal terahertz system (The shaded parts in the graph Ⅱ are only for reference)

4 結果與討論

4.1 GSH和GSSG寬頻太赫茲吸收光譜

圖3 GSH和GSSG的PXRD衍射圖Fig.3 Powder X-ray diffraction (PXRD) patterns of GSH and GSSG

圖2為GSH和GSSG在0.5～12.0 THz波段的吸收光譜。GSH在1.52、2.51、3.71、4.38、5.02、5.96、6.67、7.10、8.23、9.03、10.11和10.71 THz處有特征吸收峰(紅線)，其中5.96和10.71 THz處吸收峰的吸收強度較大，且峰形尖銳。而GSSG呈現的則是一條單調上升的吸收曲線(藍線)，沒有明顯的特征吸收峰。由于0.5～1.4 THz波段的信息受儀器檢測限影響，利用在低頻太赫茲區域有較高分辨率的光電導開關太赫茲系統探測0.2～2.8 THz范圍內GSH和GSSG的太赫茲吸收光譜(圖2插圖)。測量結果表明，0.2～2.8 THz波段GSH的太赫茲吸收峰與文獻[19,20]報道結果吻合，而GSSG依然對太赫茲波呈現無特征吸收。在之前晶體和非晶體系的太赫茲光譜研究中也觀察到類似現象。Walther等[29]利用THz-TDS檢測晶體和非晶葡萄糖的太赫茲吸收光譜，結果表明，由于晶體中糖分子的非共價鍵與太赫茲波產生協同共振響應，導致晶體糖在太赫茲波段有明顯的特征吸收峰，而非晶糖在太赫茲波段呈無特征吸收曲線。太赫茲吸收光譜還與氫鍵的作用特點密切相關，生物分子的特定晶型通常是分子在氫鍵的定向作用下有序堆疊而成[30,31]。當太赫茲光與分子晶體作用時，特定波段太赫茲的能量與晶格和氫鍵振動能量匹配，分子產生共振響應，進而呈現特征吸收峰。非晶物質內，分子通常不能按照一定規律有序排列，且存在氫鍵取向隨機的現象，容易導致非晶物質對太赫茲波呈現單調遞增的無特征吸收[32]。為了進一步驗證不同樣品存在形式對太赫茲響應的影響，采用PXRD衍射對GSH和GSSG進行了表征。圖3為GSH和GSSG的PXRD衍射圖，其中GSH有一系列較強的尖銳衍射峰，說明樣品具有晶型結構; 而GSSG在所測范圍內沒有出現衍射峰，說明GSSG沒有特定的晶型結構，是無定形態。GSH和GSSG的PXRD檢測結果與太赫茲檢測結果一致，說明太赫茲光譜對物質晶體結構有敏感響應[33]。

圖4 GSH的實驗和理論計算的太赫茲光譜Fig.4 Experimental and calculated Terahertz spectra of GSH

4.2 GSH太赫茲光譜理論分析

量子化學理論計算是解析實驗獲得的太赫茲光譜的一種有效方法[37,38]。考慮到GSH的晶體結構具有溫度敏感性[24]，本研究采用295 K溫度下的GSH初始晶胞參數進行結構優化和振動分析。圖4為理論計算獲得的GSH太赫茲光譜(藍色虛線)，并將其與實驗獲得的光譜(紅色實線)比對分析。理論計算獲得的太赫茲光譜中吸收峰的數量比實驗光譜中的多，特別是在低頻區域較明顯，這一現象與低頻區域復雜的集體振動、分子間和分子內振動耦合以及實驗測量儀器的檢測靈敏度和分辨率等因素有關[39,40]。同時，與理論計算得到的光譜相比，實驗光譜中的吸收峰有一定偏移，低頻區的偏移量較小而高頻區吸收峰的偏移量較大。由于實驗中的測量樣品是未經進一步純化的粉晶，會對吸收峰位移產生一定影響[41]。此外，理論計算的溫度是 0 K，而實驗測量的環境溫度為295 K，此溫度差異引起的晶格膨脹在一定程度上使得吸收峰發生偏移[42]。同時，儀器測量的環境因素如溫度和濕度等也會對吸收峰產生一定影響。