磁性共價有機骨架固相萃取-高效液相色譜測定柑橘中農(nóng)藥殘留

黃斯敏 胡玉斐 陳彥龍 李攻科 夏 凌

(中山大學化學學院， 廣州 510275)

1 引 言

柑橘類水果是深受消費者喜愛的水果，其種植面積廣，消費量大，但在種植、儲存與運輸?shù)倪^程中容易受到各種病蟲害的侵襲，因此會廣泛使用殺蟲劑、殺菌劑等農(nóng)藥，如新煙堿類常用殺蟲劑噻蟲嗪和吡蟲啉[1]、苯并咪唑類常用殺菌劑多菌靈和噻菌靈[2]。然而，不合理使用農(nóng)藥可能會導致柑橘類水果中殘留農(nóng)藥，并通過食物鏈的生物富集對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成危害。我國對柑橘類水果中的農(nóng)藥殘留制定了嚴格的限量標準，其中GB-2763-2019[3]規(guī)定柑橘類水果中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈農(nóng)藥殘留的最大限量標準分別為0.5、1、5和10 mg/kg。目前，這4種農(nóng)藥殘留的常用檢測方法是高效液相色譜法[4]和液相色譜-質(zhì)譜法[5]。柑橘類水果樣品基質(zhì)復雜，農(nóng)藥殘留量低，常用的檢測方法無法直接進樣實現(xiàn)準確定量分析。在液相色譜檢測前進行分離、富集等樣品前處理， 可以有效消除基質(zhì)干擾、降低檢出限，也是分析化學的研究熱點之一[6]。

磁性固相萃取(Magnetic solid-phase extraction， MSPE)因其快速、高效、易操作等優(yōu)勢而受到關注[7～9]。MSPE以磁性材料或可磁化材料作為吸附劑，吸附劑在萃取過程中可分散在樣品溶液中，與目標物充分接觸，并且能進行快速的磁性分離。在實驗操作中，不需要離心和過濾等繁瑣耗時的操作，從而達到節(jié)省實驗時間的目的。另外，MSPE還可避免固相萃取等方法在填充吸附劑時可能出現(xiàn)的高背壓或堵塞等問題[10,11]。MSPE的核心是磁性吸附劑，新型高效磁性吸附劑的研究是目前的研究重點。目前，多種功能化多孔材料已成功應用于MSPE，如共軛微孔聚合物、金屬有機骨架、沸石咪唑骨架和活性炭等。與無機沸石和金屬有機骨架等材料相比，共價有機骨架(Covalent organic frameworks， COF)具有密度低、表面積大、孔隙大小和結(jié)構(gòu)可調(diào)、易功能化等優(yōu)點[12]，已在氣體儲存[13,14]、催化[15,16]、光電子學[17,18]、化學傳感[19]和吸附[20]等方面已得到廣泛應用。如Wu等[21]設計了一種COF-PDA纖維，并結(jié)合頂空固相微萃取對蔬果中的擬除蟲菊酯進行萃取，采用氣相色譜檢測；Ji等[22]報道了一種固相萃取吸附劑NH2@COF結(jié)合HPLC對環(huán)境水樣中的6種羧酸類農(nóng)藥進行富集分析。目前，磁性共價有機骨架作為MSPE吸附劑用于柑橘類水果中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈這4種上述農(nóng)藥的同時測定的研究還未見報道。

本研究制備了一種具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性共價有機骨架復合材料(Fe3O4@COF)作為MSPE的吸附劑，并對MSPE萃取條件進行了優(yōu)化，結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測器法(High-performance liquid chromatography-ultraviolet detector，HPLC-UV)建立了同時測定柑橘類水果中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈農(nóng)藥殘留的分析方法。本方法操作簡單，檢出限低，線性范圍較寬，并成功應用于沃柑樣品中上述4種農(nóng)藥殘留的同時測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-2010液相色譜儀(日本島津公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司); DW-3型數(shù)顯電動攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司); KQ-5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Gemini500掃描電子顯微鏡(德國Zeiss公司); FEI Tecnai G2 Spirit 120 kV透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司); D8 ADVANCE 功能無機X射線粉末衍射儀(德國布魯克公司); Nicolet Magna 750 傅里葉變換紅外光譜儀(美國尼高利公司); MPMS XL-7磁學性質(zhì)測量系統(tǒng)(美國Quantum Design公司); ASAP 2020全自動比表面及微孔介孔物理吸附分析儀(美國麥克儀器公司)。

氨水(25%，m/m)、無水Na2SO4、二水合檸檬酸三鈉、乙二醇、無水乙醇、四氫呋喃、乙酸、甲苯、丙酮(分析純，廣州化學試劑廠); 噻蟲嗪(98%)、吡蟲啉(98.5%)、多菌靈(99%)和噻菌靈(98%)的標準品、三(4-氨基苯基)胺(TAPA，97%)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，98%)、硅酸四乙酯(TEOS)、均三甲苯(無水級，98%)、FeCl3·6H2O、無水乙酸鈉(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司); 均苯三甲醛(97%，南京精瑞久安生物技術有限公司); 甲醇和異丙醇(HPLC級，美國Sigma-Aldrich公司); 乙腈(HPLC級，北京Dikma公司); 實驗用水為去離子水。

標準溶液的配制：準確稱取適量標準品，用甲醇配制1.00 mg/mL噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈的混合標準儲備液，避光冷藏保存。使用時稀釋至所需濃度。

2.2 Fe3O4@COF復合材料的制備

2.2.1 Fe3O4納米微球的制備采用溶劑熱法[23]，將FeCl3·6H2O(1.69 g)、無水乙酸鈉(4.50 g)加于50 mL乙二醇中，劇烈攪拌至呈均勻懸濁液后，轉(zhuǎn)移到高壓反應釜中，在200℃ 反應12 h。通過磁性分離得到的產(chǎn)物，用超純水和乙醇分別清洗4次，最后得到Fe3O4磁性納米顆粒(Magnetic nanoparticles， MNPs), 待用。

2.2.2 MNPs的改性根據(jù)文獻[24]的方法對MNPs進行改性。將2.2.1節(jié)合成的MNPs在0.1 mol/L檸檬酸三鈉溶液中攪拌2 h后，用水充分清洗，然后分散于120 mL乙醇、30 mL超純水和2.4 mL濃氨水的混合溶液中，在機械攪拌下緩慢滴加0.8 mL TEOS，反應12 h。產(chǎn)物經(jīng)磁性分離后，用超純水和乙醇分步充分清洗，在60℃下真空干燥，得到MNPs@SiO2。稱取0.15 g MNPs@SiO2超聲分散于150 mL無水甲苯中，再滴加15 mL APTES，在110℃下回流反應8 h，產(chǎn)物經(jīng)磁性分離后, 用甲苯和乙醇充分清洗，得到氨基化的MNPs@SiO2，即改性MNPs。

2.2.3 Fe3O4@COF的制備參考文獻[25]的方法并稍作改進合成COF層材料，F(xiàn)e3O4@COF的制備方法如下：在THF-均三甲苯(3∶1,V/V)混合溶液中加入改性MNPs，超聲分散后依次加入162 mg均苯三甲醛和290 mg TAPA，繼續(xù)超聲處理。在機械攪拌下緩慢滴加4 mL 6 mol/L乙酸溶液。將反應體系在液氮中快速冷凍并抽真空，待體系回至室溫后120℃油浴反應3 d。產(chǎn)物經(jīng)磁性分離后, 用THF、水和乙醇充分清洗，在60℃下真空干燥，最后得到Fe3O4@COF。Fe3O4@COF的合成示意圖如圖1所示。

2.3 磁固相萃取

將10 mL樣品置于樣品瓶中，加入20.0 mg Fe3O4@COF，在室溫下，通過平臺振蕩器振蕩20 min，將磁鐵靜置于樣品瓶的外壁，磁性分離后，棄去上清液。加入1 mL甲醇，振蕩5 min，磁性分離，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜，待HPLC分析。

圖1 Fe3O4@COF的合成示意圖Fig.1 Schematic diagram for synthesis of Fe3O4@COF A. 1,3,5-Benzenetricarboxaldehyde; B, Tris(4-aminophenyl)amine; COF. Covalent organic frameworks; MNPs. Magnetic nanoparticles; TEOS. Tetraethyl orthosilicate; ATPES. 3-Aminopropyltriethoxysilane.

2.4 HPLC 條件

色譜柱：Diamonsil Plus C18-B(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm); 流動相: 乙腈(A), 水(B); 梯度洗脫程序: 0～8 min 20% A; 8～20 min 30% A。流速: 1.0 mL/min; 柱溫: 30℃; UV檢測波長: 244 nm; 進樣量: 20.0 μL。

2.5 樣品處理

沃柑樣品購于本地市場。取沃柑樣品對瓣果肉, 切成小塊后制成勻漿。稱取勻漿10.0 g于50 mL離心管中, 加入10 mL甲醇，振蕩10 min， 4000 r/min離心6 min，重復兩次。將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，加入1.00 g無水Na2SO4，振蕩10 min，4000 r/min離心6 min，取上清液，在60℃下減壓蒸餾。將提取物重新溶解在0.1 mL甲醇中，用9.9 mL水稀釋后即為樣品溶液，待測。

2.6 模擬計算

通過Gaussian 09軟件，在密度泛函理論方法優(yōu)化結(jié)構(gòu)的基礎上，計算噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈4種目標物的分子大小和所制備材料COF部分的孔徑大小[26]。

3 結(jié)果與討論

3.1 Fe3O4@COF的表征

由Fe3O4@COF的掃描電鏡圖(圖2A)和透射電鏡圖(圖2B)可知，此復合材料為核殼型結(jié)構(gòu)，外部絮狀COF層包裹內(nèi)部磁核，粒徑約為120 nm。

圖2C是改性MNPs、Fe3O4@COF和COF的X-射線衍射圖譜。在改性MNPs(曲線a)和Fe3O4@COF(曲線b)圖譜中，2θ為30.2°、35.4°、43.1°、53.5°、57.1°、62.7°處的衍射峰對應純立方尖晶石系Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面(JCPDS卡，03-065-3107)的特征吸收峰，在Fe3O4@COF(曲線b)和COF(曲線c)圖譜中，2θ為6.67°、11.27°處的衍射峰對應COF外殼的吸收峰，表明COF層成功包裹在改性MNPs外部。

圖2E為改性MNPs和Fe3O4@COF的磁滯回線圖，改性MNPs的飽和磁化強度為6.89 emu/g，F(xiàn)e3O4@COF的飽和磁化強度為2.79 emu/g。Fe3O4@COF飽和磁化強度的降低，表明COF層成功包裹在改性MNPs外部形成復合材料。

圖2 (A)Fe3O4@COF的掃描電子顯微鏡圖; (B)Fe3O4@COF的透射電子顯微鏡圖; (C)改性MNPs(a)、Fe3O4@COF(b)和COF(c)的X射線晶體衍射圖; (D)改性MNPs(a)、Fe3O4@COF(b)和COF(c)的傅里葉紅外光譜圖; (E)改性MNPs(a)和Fe3O4@COF(b)的磁滯回線圖Fig.2 (A) Scanning electronic microscope image of Fe3O4@COF; (B) Transmission electron microscope image of Fe3O4@COF; (C) X-ray diffraction pattern of (a) modified MNPs, (b) Fe3O4@COF and (c) COF; (D) Fourier transform infrared spectra of (a) modified MNPs, (b) Fe3O4@COF and (c) COF; (E) Hysteresis loops of (a) modified MNPs and (b) Fe3O4@COF

3.2 MSPE條件優(yōu)化

采用單一變量法，對MSPE的Fe3O4@COF吸附劑用量、溶液pH值、萃取時間、洗脫溶劑和洗脫時間等萃取條件進行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見圖3。實驗所用的混合樣品中4種農(nóng)藥濃度均為100 μg/L。

3.2.1 Fe3O4@COF用量考察了Fe3O4@COF吸附劑用量(5～25 mg)對萃取效率的影響，萃取時間設為60 min，磁性分離出的上清液過膜后，采用HPLC進行分析。由圖3A可知，材料對噻菌靈的萃取效率很高。當吸附劑用量從5 mg增加到15 mg時，其它3種農(nóng)藥目標物的萃取效率迅速提高，當吸附劑用量在15 mg以上時，萃取效率增加緩慢; 在吸附劑用量為20和25 mg時, 萃取效率的變化趨于平緩。因此， 選擇MSPE吸附劑最優(yōu)用量為20 mg。

3.2.2 萃取時間考察萃取時間(5～30 min)對萃取效率的影響，F(xiàn)e3O4@COF用量20 mg, 結(jié)果如圖3B所示。結(jié)合4種農(nóng)藥目標物在不同萃取時間下的萃取效率，在保證較高萃取效率下盡量縮短萃取時間，選擇MSPE的最優(yōu)萃取時間為20 min。

3.2.3 pH值的影響考慮到實際樣品為柑橘類水果，柑橘的pH≈3.5[27]，以及在樣品處理中酸性物質(zhì)的稀釋，因此考察樣品pH值為4.0～8.0時的萃取效率， Fe3O4@COF用量20 mg，萃取時間20 min。實驗結(jié)果(圖3C)表明，在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)，樣品pH值對萃取效率影響不顯著，因此在MSPE過程中不需調(diào)節(jié)pH值。

3.2.4 洗脫溶劑在Fe3O4@COF用量20 mg、萃取時間20 min、洗脫時間60 min的條件下，研究乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、異丙酮5種溶劑作為洗脫溶劑對洗脫效率的影響。 如圖3D所示，甲醇對農(nóng)藥目標物具有最佳的解吸效率。因此，選擇甲醇作為溶劑。

3.2.5 洗脫時間在Fe3O4@COF用量20 mg、萃取時間20 min、洗脫溶劑為甲醇的條件下， 考察洗脫時間(1～15 min)對萃取效率的影響。如圖3E所示，隨洗脫時間的增加，4種農(nóng)藥目標物的洗脫效率快速上升，在5 min以后洗脫效率反而下降。選擇MSPE最優(yōu)洗脫時間為5 min。

圖3 磁固相萃取條件優(yōu)化: (A)吸附劑用量; (B)萃取時間; (C)pH值; (D)洗脫溶劑; (E)洗脫時間a. 噻菌靈; b. 吡蟲啉; c. 多菌靈; d. 噻蟲嗪; S1. 甲醇; S2. 乙醇; S3. 丙酮; S4. 乙腈; S5. 異丙酮Fig.3 Optimization of magnetic solid-phase extraction conditions: (A) adsorbent dosage; (B) extraction time; (C) pH value; (D) desorption solvent; (E) desorption timea. thiabendazole; b. imidacloprid; c. carbendazim; d. thiamethoxam; S1. Methanol; S2. Ethanol; S3. Acetone; S4. Acetonitrile; S5. Isopropyl-ketone

3.3 吸附機理

Fe3O4@COF復合材料主要由Fe3O4磁核提供磁性，由COF外殼吸附富集目標物分子。通過Gaussian 09軟件對4種農(nóng)藥目標物分子的大小以及COF外殼的孔徑大小進行模擬計算。由圖4可知，COF孔徑大小與目標物分子大小相匹配，目標物分子可通過COF孔，且因為目標物分子大小與COF孔徑相近，主客體之間可能存在π-π 堆積作用和氫鍵作用，使其更加穩(wěn)定，有利于Fe3O4@COF對目標物分子進行吸附。

圖4 Gaussian軟件模擬計算示意圖: (A)噻蟲嗪、(B)吡蟲啉、(C)多菌靈和(D)噻菌靈的分子尺寸; (E)COF的孔徑Fig.4 Gaussian simulation illustration: the molecular size of (A) thiamethoxam, (B) imidacloprid, (C) carbendazim and (D) thiabendazole; (E) the aperture of COF

3.4 方法的分析性能

在優(yōu)化條件下， 4種農(nóng)藥目標物的線性關系、相關系數(shù)、線性范圍及檢出限等見表1。在1～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)(吡蟲啉為5～1000 μg/L)，噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈的濃度與HPLC色譜峰面積具有良好的線性關系，相關系數(shù)在0.9997～0.9998之間，檢出限(S/N=3)在0.27～1.22 μg/L范圍內(nèi)。滿足國標GB-2763-2019[3]對柑橘樣品中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈等農(nóng)藥殘留檢測的限量標準要求。

表1 Fe3O4@COF-MSPE-HPLC-UV檢測4種農(nóng)藥殘留的方法性能參數(shù)

本方法與文獻方法的比較見表2。本研究建立的Fe3O4@COF-MSPE-HPLC-UV方法的線性范圍較寬，檢出限較低，可實現(xiàn)柑橘類水果中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈4種農(nóng)藥殘留的同時檢測。此外，MSPE避免了離心、過濾等耗時的前處理步驟，實驗操作更快速簡便。

表2 本方法與文獻報道的農(nóng)藥殘留檢測方法比較

3.5 實際樣品分析

圖5 不同樣品的色譜圖: (a)4種農(nóng)藥標準溶液(100 μg/L); (b)沃橘樣品; 加標濃度為50 μg/L(c)和100 μg/L(d)的沃橘樣品Fig.5 Typical chromatograms of (a) four standard pesticide mixture (100 μg/L), (b) citrus sample, citrus sample spiked with 50 μg/L (c) and 100 μg/L (d) pesticide1. Thiamethoxam; 2. Imidacloprid; 3. Carbendazim; 4. Thiabendazole.

采用Fe3O4@COF-MSPE-HPLC-UV方法對某批次沃柑樣品中的4種農(nóng)藥殘留進行分析。沃柑樣品、加標濃度為50 μg/L和100 μg/L的沃柑樣品以及濃度為100 μg/L的標準溶液的HPLC色譜圖及分析結(jié)果如圖5與表3所示。沃柑樣品中吡蟲啉含量為92.06 μg/kg，噻菌靈含量為10.19 μg/kg，符合國家標準[3]的限量要求。4種農(nóng)藥殘留的加標回收率為92.1%～104.0%， RSD為1.2%～8.3%。本方法精密度良好，可以滿足實際樣品柑橘類水果中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈4種農(nóng)藥殘留的分析需求。

表3 沃橘樣品種4種目標農(nóng)藥殘留的測定

4 結(jié) 論

制備了一種具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@COF復合材料，并將其作為磁性吸附劑，結(jié)合MSPE和HPLC-UV建立了測定柑橘類水果樣品中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈4種農(nóng)藥殘留的分析方法。在改性MNPs表面修飾COF層，所制備的Fe3O4@COF具有良好磁性和易于分離的優(yōu)點。本方法操作簡單，線性范圍寬，檢出限低，適用于柑橘類水果樣品中噻蟲嗪、吡蟲啉、多菌靈和噻菌靈4種農(nóng)藥殘留的同時分析。