玉米赤霉烯酮化學發光免疫分析檢測系統設計

吳才章，劉冬冬，胡 良

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玉米赤霉烯酮化學發光免疫分析檢測系統設計

吳才章，劉冬冬，胡 良

（河南工業大學電氣工程學院，鄭州 450001）

為了保障糧食安全，該研究根據玉米赤霉烯酮抗原抗體反應，以及辣根過氧化物酶催化魯米諾過氧化氫反應產生化學發光，設計一款應用于糧食行業的玉米赤霉烯酮檢測系統。采用側窗型高精度光電倍增管MD983以及16位AD轉換芯片，實現化學發光強度信號的準確測量；步進電機驅動旋轉精密轉臺，通過優化步進電機的S型脈沖驅動控制曲線參數，完成轉臺的高精度定位控制，實現光電倍增管的測試窗口和化學發光孔精確對準；通過精密直線導軌滑臺驅動加樣器的進給，實現反應液微米量級的準確微量加樣。利用競爭性免疫分析方法，使得赤霉烯酮毒素為0g/kg情況下，化學發光反應具有最大發光量，解決真菌毒素低濃度情況下的檢測精度難題。經過試驗驗證，系統檢出限為0.1g/kg，樣品加標回收率在90%以上，標準曲線決定系數為0.996 5，系統檢測玉米赤霉烯酮的線性范圍為0~60g/kg。研究表明建立的玉米赤霉烯酮檢測系統滿足國家糧食行業對于糧食中玉米赤霉烯酮含量檢測要求，為真菌毒素檢測儀器的國產化提供參考。

糧食；檢測系統；玉米赤霉烯酮；化學發光免疫分析；光電倍增管

0 引 言

糧食是活的生命體，儲藏期間由于自身的呼吸氧化、各種霉的活動，以及外界環境的影響，糧食在不斷發生各種生理和化學變化[1]。糧食微生物在糧食中普遍存在且種類多樣，包括細菌，放線菌，以及真菌類中的霉菌。糧食中的霉菌特別是一些有害霉菌不僅可以導致糧食發生霉變，而且還可以產生具有強烈毒性和致癌性的真菌毒素物[2]。以玉米赤霉烯酮為例，它能對肝臟、腎臟、生殖系統和免疫系統產生明顯的損傷，對細胞和遺傳性也有毒性作用，能引起細胞凋亡、畸形、損害DNA等[3]。隨著社會的發展和人民生活水平的不斷提高，人們的飲食觀念也在發生轉變，已不再滿足于吃飽吃好，更關注吃得安全、吃得健康，糧食儲藏過程中真菌毒素的存在已經成為我國糧食、食品安全的重要隱患。為了減少糧食中玉米赤霉烯酮對人體的危害,國家出臺了相關的法律法規限制食品中和動物飼料中的玉米赤霉烯酮含量，國家標準規定飼料中的檢測限小于50g/kg，食品中的檢測限小于60g/kg[4]。

目前檢測真菌毒素常用的方法主要有高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]和免疫學檢測法[7]等。前兩種方法檢測靈敏度和準確度高，但是需要昂貴的專業設備和專業人員的復雜操作，檢測周期也比較長[8-9]。免疫學檢測方法是利用抗原與抗體的特異性結合，再通過同位素、熒光素或酶等標記技術加以放大和顯示[10-11]。該方法與其他方法相比，具有特異性強、靈敏度高的特點，較為典型的是酶聯免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay），但是該方法有時會出現交叉反應、假陽性反應，組織樣品處理時間長，pH值有時會影響檢測結果等現象，因此檢測的穩定性差、準確性不能得到保證。

為了克服酶聯免疫法的缺點，科研工作者進一步研究出了化學發光免疫分析法[12-13]。其利用化學發光作為抗原抗體反應的指示系統，發光物質直接作為抗原抗體的標記物，具有靈敏度高、線性寬、操作簡單、結果準確等優點[14]。化學發光免疫分析方法最早應用于臨床，在醫學領域已經成為一類普遍采用的快速檢測方法[15]。由于化學發光免疫法能夠安全快速、準確檢測出需要檢測的抗原抗體，因此國內外的學者試圖把該方法引進到食品檢測中，開展了一些初步的試驗研究[16]。但是中國糧食產品的附加值比較低，糧食儲藏企業對真菌毒素檢測的價格較為敏感。化學發光免疫分析所用的試劑盒成本較高，再加上檢測儀器價格昂貴，導致該方法在糧食行業的應用受到了很大的限制。研制低成本的儲糧真菌毒素化學免疫發光快速檢測儀器，可滿足中國糧食儲藏企業的需要，成為當務之急。本文針對中國糧食中玉米赤霉烯酮的檢測問題，設計一款應用于糧食行業的玉米赤霉烯酮檢測系統。根據化學發光免疫反應產生化學發光，采用競爭性免疫分析方法，并進行試驗測試，結果為真菌毒素檢測儀器的國產化提供參考。

1 化學發光酶免疫分析檢測系統設計

1.1 系統整體設計

系統主要由化學反應池、定位控制系統、加樣控制系統、數據采集系統4個部分組成。反應池是由5個位于旋轉精密轉臺上的化學發光孔組成；定位控制系統由步進電機和精密轉臺組成；加樣系統由直線導軌滑臺和加樣器組成；數據采集系統由光電倍增管模塊MD983、AD轉換器件和單片機組成。化學反應池、光電倍增管模塊、旋轉轉臺、加樣器、采樣系統置于恒溫箱內部，恒溫箱購自上海一恒科學儀器有限公司，恒溫箱置于暗室內，控制恒溫箱的溫度誤差范圍為±0.5 ℃。免疫分析儀結構示意圖如圖1所示[17-18]。

1.加樣器 2.MD983 3.反應池 4.濾光片 5.精密轉臺 6.恒溫箱 7.外暗室 8.單片機

1.2 數據采集系統設計

數據采集系統以嵌入式微處理器STM32F103ZET6為核心，化學發光強度檢測采用PerKin Elmer的MD983光子計數模塊，內置高壓電路，測量精度可達單光子量級。MD983輸出模擬電壓信號，需要進行模數轉換，盡管STM32內置了12位高速A/D轉換器，但是這種內置的A/D轉換器很難滿足系統的精度要求。因此，系統外接美國Analog Devices, Inc.生產的A/D轉換專用芯片AD7606，該芯片屬于逐次逼近型16位模擬數字轉換器，內置數字濾波器，最高采樣頻率可達200 ksps，可滿足系統的精度要求[19]。

AD7606提供串行和并行兩種接口模式，系統采用SPI串行方式與單片機進行通訊和數據交換。AD7606 OS[2:0]是采樣倍率選擇引腳，與STM32單片機的PF[13:15]連接。RANGE是模擬輸入電壓范圍選擇引腳，接單片機的PB8。PAR/SER是通訊接口模式選擇引腳，高電平時為SPI串行接口模式，低電平時為并行接口模式，與單片機的PB15連接。RD/SCLK是時鐘輸入引腳，DB7/Dout串行數據輸出引腳，分別接單片機的PB13和PB14。CS是片選引腳，接單片機的PA4，RST為復位引腳，接單片機的PB5。CVA和CVB是開始轉換引腳，CVA控制V1～V4通道，CVB控制V5～V8通道，接單片機的PB6和PB7。STM32單片機與AD7606接口電路如圖2所示。

圖2 STM32單片機與AD7606接口電路圖

1.3 加樣控制系統設計

微量加樣系統采用步進電機、絲杠導軌滑臺、進樣器以及固定板組成，加樣系統的結構示意圖如圖3所示。為了實現加樣量的精確控制，加樣系統加裝了旋轉編碼器。設置完滴定液體積后，單片機控制步進電機驅動絲桿的上下運動，進而帶動加樣器的活塞運動，實現設置體積滴定液加注功能。加樣系統在保證化學發光反應加樣量的一致性、控制反應進程、提高檢測精度、控制測量成本等方面具有重要作用。

1.編碼器2.步進電機3.圓柱導軌4.滾珠絲桿5.提拉固定板6.柱塞桿7. 250 μL進樣器8.固定板9.滴定頭

加樣分辨率是檢測系統重要的參數。加樣器采用上海高鴿工貿有限公司的250L進樣器。控制器發送脈沖數與進樣量的關系如式（1）。

式中為進樣量，L；為脈沖數；為步進電機步距角，(°)；P為絲桿導程，mm；為進樣器總容量，L；為進樣器行程，mm。

加樣系統中傳動機構采用滾珠直線導軌滑臺（含42步進電機），其直線絲桿的導程=5 mm，進樣器總容量=250L，進樣器行程=50 mm。為避免電機轉子在非整步位置停止時產生振動和噪音，控制步進電機整步運行為1，這樣步進電機的步距角度為1.8°，當步進電機接收到一個脈沖以后，加樣系統的加樣分辨率如式（2）。

由式（2）可知，加樣系統的加樣分辨率Δ=0.125L。考慮到絲桿和導軌等的機械誤差和間隙，加樣量很難控制到這個量級，具體加樣量的多少還要通過高精度的旋轉編碼器計算。

1.4 轉臺定位控制系統

如圖1所示，5個化學反應發光孔均勻分布在精密轉臺的一個圓周上，每兩個孔之間的夾角是72°。加樣器加樣孔和光電倍增管的測試孔位于一個同樣大小的圓周上，位于加樣孔所在圓周的正上方，兩者之間的夾角也是72°。工作時首先將加樣孔對準化學發光孔，單片機控制加樣器滴定一定量的化學發光試劑到化學反應發光孔，發生化學發光反應。然后步進電機驅動轉臺，實現光電倍增管測試窗口和化學發光孔精確對準，單片機即可采集相應的化學發光信號。定位控制系統由步進電機和旋轉精密轉臺組成，轉臺的定位精度和旋轉運動精度是實現分析儀高精度測量的關鍵。

旋轉臺的定位采用兩級方式定位，即通過霍爾元件實現粗定位，通過發光強度測試實現精定位。旋轉臺安裝若干霍爾元件實現定位功能，但是霍爾元件定位存在一定的誤差，難以實現毫米量級的精確定位，為此考慮通過化學發光強度的實時檢測，實現旋轉臺的精確定位。由于反應池中的化學免疫發光反應的發光會持續一段時間，而且發光強度會保持基本恒定。在此時間段內，左右移動轉臺，可以通過尋找最大化學發光強度的方法進行旋轉臺的精確定位。

在精確定位的基礎上，轉臺的旋轉精度主要通過嚴格控制步進電機的驅動脈沖數來實現，然而在一定負載下，步進電機啟動和停止時，容易出現丟步現象，影響轉臺的旋轉精度，進而影響化學發光孔和光電倍增管的測試窗口精確對準。由于購置的精密轉臺難以安裝旋轉編碼器等位置傳感器，為了消除步進電機的失步現象，采用S形加減速曲線對步進電機的驅動脈沖頻率進行控制[20]。

2 玉米赤霉烯酮檢測系統檢測試驗

2.1 試驗材料

96孔玉米赤霉烯酮抗原包被反應板、玉米赤霉烯酮標準樣品溶液、Lluninol-H2O2化學發光試劑（魯米諾濃度為2.5 mol/L、過氧化氫的濃度為4×10-3mol/L）、抗體工作液、酶標二抗（辣根過氧化物酶）、洗滌液等均購自上海生工生物股份有限公司；純凈玉米樣品購買于鄭州市某糧食市場；含玉米赤霉烯酮的實際樣品購買于鄭州市某糧食收購站，在實驗室潮濕條件下經過不同時間的存放；化學發光免疫分析檢測系統為自主研制。

2.2 試驗步驟

1）將玉米樣品利用專用粉碎機進行粉碎，得到玉米粉試驗樣品，并進行編號。

2）每組樣品稱取4 g，然后加入100 mL按照體積比7:3配置好的甲醇水溶液，震蕩搖勻5 min，使得溶液充分溶解。

3）每組樣品取10 mL，設置高速離心機的轉速為5 000 r/min，離心3～5 min以后，分別取出上清液即為待測樣液。

4）根據需要檢測的樣品數量，在精密轉臺反應池內插入相應數量的酶標板微孔。通過更換進樣器，由計算機控制加樣器在各個微孔中加入50L待測樣品溶液。

5）控制加樣器分別在標準樣品孔和待測樣品孔加入50L抗體工作液和50L酶標二抗溶液，然后在恒溫箱中恒溫25 ℃孵育30 min左右。

6）孵育結束后，人工取出微孔板，倒掉微孔里面的液體溶液，加入250L洗滌液，放置1 min以后倒掉液體，重復洗滌3～5次以后，拍干微孔板里面的殘余的液體。將充分反應以后的微孔放回到恒溫箱中，加入發光試劑，通過檢測系統檢測發光強度。

2.3 化學發光免疫分析定標曲線的建立

根據《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》GB2761-2017規定儲糧及糧食制品中玉米赤霉烯酮（Zearalenone）的檢測限小于60g/kg。以0、5、20、40、60g/kg 濃度的玉米赤霉烯酮（Zearalenone）標準樣品進行測試，繪制定標曲線。每組反應測量時間是5 min，第4分鐘作為有效采樣，此后每秒種采樣一次，采樣60次，計算平均值X和標準差[21-22]。

由于采用競爭性化學發光酶免疫分析的方法，理論上0g/kg標準樣品濃度有最大的發光值，因此以0g/kg為參考對象，其他濃度發光強度和0g/kg發光強度比值的百分數作為相對發光強度。不同濃度條件下ZEN化學發光相對強度定標曲線如圖4所示，通過origin軟件擬合標準曲線為=?0.013+0.990，擬合曲線呈現良好的線性，決定系數為0.996 5。

圖4 玉米赤霉烯酮化學發光相對強度定標曲線

2.4 加標回收率試驗

在純凈玉米樣品中分別添加標準玉米赤霉烯酮（Zearalenone）抗原，添加后形成加標樣品（ZEN含量分別為20、50、100g/kg），按照試驗步驟進行測試，每個濃度檢測3次。ZEN標準樣品的加標回收率試驗結果如表1所示。結果表明該方法檢測的ZEN線性范圍內回收率在90%以上，并且呈現出濃度越低回收率越高的規律，說明設計的檢測系統提取率、重現率良好。

表1 玉米赤霉烯酮標準樣品的加標回收率

為了驗證自主研制的真菌毒素檢測儀的準確性，對3種未知實際樣品進行測量比對。本文方法和酶聯免疫分析法樣品測定比對結果如表2所示。

表2 化學發光免疫分析法和酶聯免疫法比對結果

2.5 檢出限測量及計算

對0g/kg樣品（最大發光強度）平行測定20次，計算其相對發光強度的平均值和標準差，將3倍標準差乘以ZEN化學發光相對強度定標曲線的斜率（置信常數取3）[16,23]，得到的濃度即為檢出最低濃度，該方法檢出限為0.1g/kg。

3 結 論

1）本文采用化學發光免疫分析法，根據玉米赤霉烯酮抗原抗體反應，以及辣根過氧化物酶催化魯米諾過氧化氫反應產生化學發光，設計一款應用于糧食行業的玉米赤霉烯酮檢測系統。

2）采用高性能的STM32F103ZET6作為化學發光免疫分析儀的主控芯片，光電倍增管作為數據采集系統的核心器件，配合定位控制系統、加樣控制系統和采樣系統實現化學免疫發光強度的測量。最終完成玉米真菌毒素含量的定量檢測。

3）經過試驗驗證，該方法標準樣品加標回收率在90%以上，標準曲線決定系數為0.996 5，線性范圍為0～60g/kg，檢出限為0.1g/kg，說明該檢測系統具有良好的重現性，滿足國家糧食行業對于糧食中玉米赤霉烯酮含量的檢測要求。

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Design of chemiluminescence immunoassay detection system for zearalenone

Wu Caizhang, Liu Dongdong, Hu Liang

(450001,)

In order to ensure food safety, a zearalenone(ZEN) detection system was developed based on the measurement of the weak chemiluminescence signal of the reaction between the luminol and hydrogen peroxide(H2O2) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP) labeled by ZEN for the food industry. The high-precision photomultiplier tube MD983 with side window and 16-bit AD conversion chip were used to realize accurate measurement of the chemiluminescence intensity signal. Rotating precision turntable was drived by the stepping motor. By optimizing the parameters of S-type pulse drive control curve of the stepping motor, the high-precision positioning control of the turntable was completed, and the test window of the photomultiplier tube and the chemiluminescence hole were accurately aligned. The accurate micro-sampler was driven by a linear guide slide table, and the accurate micro-sample injection of the micron level of the reaction liquid was realized. The competitive immunoassay method was adopted. When the concentration of ZEN was equal to 0g/kg, there was a maximum amount of luminescence, which solved the problem of detection accuracy under the condition of low concentration of ZEN. The results showed that the detection limit of the system was 0.1g/kg, the standard addition recovery was more than 90%, the determination coefficient of the standard curve was 0.995 6, and The linear range of the system for detecting zearalenone was 0-60g/kg. The results show that the Zen detection system can meet the requirements of national food industry for Zen content detection in cereals, and provide a reference for the localization of mycotoxin detection instruments.

grain; detection system; zearalenone; chemiluminescence immunoassay; photomultiplier tube

吳才章，劉冬冬，胡良. 玉米赤霉烯酮化學發光免疫分析檢測系統設計[J]. 農業工程學報，2020，36(17)：308-312. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.17.036 http://www.tcsae.org

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2020-02-12

2020-06-04

河南省科技攻關項目（182102110461）

吳才章，教授，研究方向：光電檢測技術在糧油食品方面的應用研究。Email：wucaizhang@haut.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.17.036

S24; TS207.4

A

1002-6819(2020)-17-0308-05