HPLC-MS/MS 法同時測定口服液保健食品中非法添加的降壓和壯陽抗疲勞類藥物

曾 羲，戚 平，汪 寧，林子豪，錢振杰，周慶瓊，蔡偉誼，彭名軍

（廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400）

0 引言

保健食品是指具有特定保健功能或以補充維生素、礦物質為目的的食品[1]。近年來，傳統觀念認為，保健食品比藥品更安全、更健康且無副作用，口服液類保健食品也因其食用方便、吸收率高等優勢備受消費者青睞，使得保健品行業呈現出飛速發展的態勢[2]。目前，我國批準的保健食品功能有27 種[3]，其中降壓類和壯陽抗疲勞類保健食品對消費者的吸引力較大，且添加的可能性也較大[4-5]。一些商家為牟取暴利，在保健食品中添加目的性藥物，以達到見效快的目的，從而增加了保健食品的安全隱患[6-9]。

近年來，保健食品中非法添加藥物常用的方法有氣相色譜-串聯質譜法[10]、超高效液相色譜法[6，11]、（超） 高效液相色譜－串聯質譜法[9，12-13]、QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法、超高液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜法等。其中，氣質法需要衍生化處理，較繁瑣費時；液相法對基質復雜的樣品定性時易出現假陽性；液相質譜法的掃描方式選擇性強、靈敏度高、定量及定性能力強，可以檢測出多組分超低含量的化合物。

基于近年來保健食品中易檢出的項目，選擇了22 種降壓類和壯陽抗疲勞類非法添加藥物，綜合檢測成本、提取效率和同分異構體分離鑒定等因素，建立了高效液相色譜-串聯質譜同時檢測口服液保健食品中非法添加的22 種降壓類和壯陽抗疲勞藥物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口服液保健食品，購于當地市場；實驗室用22 種藥物標準物質（純度均大于98%），北京振翔科技有限公司提供；乙腈和甲醇（色譜純），美國Thermo Fisher Scientific 公司提供；實驗室用水為超純水；其他化學試劑均為分析純，廣州化學試劑廠提供。

1.2 儀器與設備

API4000 型高效液相色譜-串聯質譜聯用儀，美國ABSCIEX 公司產品；2600TH 型超聲清洗器，上海安譜科學儀器有限公司產品；SECURA224-1CN 型電子天平，美國Sartorious 公司產品。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

（1） 標準溶液的配制。準確稱取上述標準品適量，用甲醇振蕩溶解，配成質量濃度為1.0 mg/mL 的單個標準儲備液，于-20 ℃下避光密封貯存。分別精密量取標準儲備液適量用甲醇定容，使用前用樣品基質提取液稀釋成6 個標準濃度的工作液。工作液的標曲范圍為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 ng/mL。

（2） 樣品溶液的配制。準確稱取1.000 0 g 樣品于50 mL 容量瓶中，加入約40 mL 甲醇- 水溶液（50∶50，V/V），超聲提取10 min，取出冷卻至室溫后，再定容至50 mL，過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～1.5 min，90% B；1.6～3.0 min，90%～65% B；3.1～8.0 min，65%～10% B；8.1～9.0 min，10% B；9.1～10.0 min，90% B。柱溫40 ℃，進樣量10 μL，流速0.3 mL/min。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子（ESI+） 源，噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度550 ℃，霧化氣壓0.38 MPa，輔助加熱氣壓0.38 MPa，氣簾氣0.17 MPa。多反應監測（MRM）質譜。

22 種非法添加違禁藥物的質譜參數及保留時間見表1。

表1 22 種非法添加違禁藥物的質譜參數及保留時間

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

由于目標化合物的數量較多，故選用較長的Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）柱進行分離。分別考查了以0.1% 甲酸（V/V）-10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇和10 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇等4 種體系作為流動相，觀察各流動相的分離效果。結果表明，0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈作為流動相時，各目標化合物的響應均較優，且檢測靈敏度和離子化效率最高。

目標化合物阿替洛爾的極性較大，保留時間較短，故0～3 min 采用較高比例的水相延緩出峰時間，3～8 min 不斷提高有機相的比例能較好地分離出其他21 種化合物，且同分異構體（羥基豪莫西地那非和代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非） 均能夠較好地分離。故綜合以上因素得到1.3.2 中的色譜條件。

22 種化合物的總離子色譜圖見圖1。

2.2 質譜條件優化

分別將22 種非法添加物的標準儲備液（1 mg/mL） 用甲醇稀釋成100 ng/mL 的對照液，在正離子模式下，直接推針進樣，優化質譜條件。發現22 種目標化合物在正離子模式下均有較好響應。確定母離子后，用子離子掃描方式選擇相對離子豐度高的2 個作為二級碎片離子。在這22 種藥物中，有3 組同分異構體，分別為羥基豪莫西地那非和硫代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非，對二級碎片離子進行比對分析，通過不同的出峰時間，結合選擇不同子離子分析鑒別，最終得到1.3.3 中的質譜條件。

圖1 22 種化合物的總離子色譜圖

2.3 樣品前處理條件優化

參考胡青等人的研究結論，用純甲醇為提取溶劑，并優化提取條件，采用甲醇-水（50∶50，V/V）作為提取溶劑。

2 種提取溶劑的提取回收率比較見圖2。

圖2 2 種提取溶劑的提取回收率比較

由圖2 可知，甲醇為提取溶劑時，有3 種化合物的提取回收率低于80%，且利血平的提取回收率僅有50%，其可能原因是利血平極易溶于水不溶于甲醇。當采用甲醇-水（50∶50，V/V） 作為提取溶劑時，各目標化合物的提取回收率均在80%～120%，利血平的提取回收率顯著增加。因此，以甲醇-水（50∶50，V/V） 為提取溶劑。

比較了不同超聲時間（5，10，15 min） 對目標化合物的提取效率影響，結果見圖3。從不同超聲時間的提取回收率看，超聲時間在10，15 min 時，22 種目標化合物的提取效率均介于80%～120%，當超聲時間為5 min 時，有6 種目標化合物的提取回收率在80%以下。故在進行方法學驗證和實際樣品檢測時，選用超聲時間為10 min。

超聲時間的提取回收率比較見圖3。

圖3 超聲時間的提取回收率比較

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限的測定

按1.3.1 中標準曲線的配制方法，在1.3.2 和1.3.3 儀器條件下，依次進樣10 μL 進行分析，在1.0～50.0 ng/mL 線性范圍內，以目標化合物的峰面積為縱坐標（y），以質量濃度（x，ng/mL） 為橫坐標，通過Multiquant 軟件進行標準曲線的繪制，根據3 倍信噪比（S/N=3） 和10 倍信噪比（S/N=10） 分別計算檢出限（LOD） 和定量限（LQD），各種目標化合物在線性范圍內的相關系數（r） 均大于0.99。

2.4.2 加標回收率試驗及精密度

對經檢測不含非法添加化學藥物的空白樣品（紅牛維生素功能飲料） 進行加標回收率的試驗和精密度試驗。于空白樣品中添加低（0.1 μg/g）、中（0.5 μg/g） 和高（1.0 μg/g） 3 個水平標準溶液，按1.3 中方法進行樣品前處理，取6 次試驗結果的平均值計算加標回收率和精密度。

22 種非法添加違禁藥物的標準曲線、相關系數、檢出限、定量限、回收率和相對標準偏差（n=6） 見表2。

22 種非法添加化學藥物的回收率介于77.15%～117.62%，相對標準標準偏差（RSD） 為0.05%～10.65%（n=6），滿足日常檢測的要求。

2.5 實際樣品的測定

在市場隨機購買專項保健食品10 種，利用該方法進行檢測，發現其中一款壯陽類液體保健食品中紅地那非和西地那非有較低劑量檢出，含量分別為0.073 μg/g 和0.10 μg/g。可見保健食品市場非法添加現象較為普遍，市場監督管理局應予以高度重視。

3 結論

采用甲醇-水超聲提取，建立了高效液相色譜-串聯質譜法同時測定液體保健食品中22 種非法添加的違禁藥物。該方法前處理簡單、分析時間短，檢出限、精密度和回收率均能滿足實驗檢驗工作，在快速、準確地對保健品中常見的降壓藥和壯陽抗疲勞類等非法添加藥物進行同時測定，大大提高了日常檢驗的工作效率，為加強保健食品市場的監管和檢驗提供了重要的技術支撐。

表2 22 種非法添加違禁藥物的標準曲線、相關系數、檢出限、定量限、回收率和相對標準偏差（n=6）