生活飲用水中大腸埃希氏菌實驗室檢測探討

黃英哲

（賓陽縣疾病預防控制中心檢驗科 廣西 南寧 530400）

水樣中的細菌包括很多屬和很多種，我國《生活飲用水衛生標準》2006版[1]的衛生學評價標準是以菌落總數、總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌4 項作為微生物指標。三種大腸菌群的邏輯關系如下：總大腸菌群＞糞大腸菌群＞大腸埃希氏菌。大腸埃希氏菌，是總大腸菌群、(耐熱)大腸菌群的主要種類。大腸埃希氏菌被檢出，表示水體受到腸道致病菌污染的可能性更大[2]。

生活飲用水微生物指標除了與外界條件有關外，實驗室檢測內部質量控制也至關重要[3]。只有做好實驗室質部質量控制，才能保證檢測對象結果真實可靠。為了檢驗本實驗室大腸埃希氏菌檢測能力，本實驗室按照GB/T5750.12－2006 大腸埃希氏菌多管發酵法，開展了生活飲用水中大腸埃希氏菌檢測的質控活動，質控活動達到如下目標：

1）使用工作中發現的耐熱大腸菌群、標準菌株產氣腸桿菌、標準菌株大腸埃希氏菌三種菌進行試驗，觀察不同大腸菌群在EC-MUG 培養基熒光效果，取得陽性標本熒光視覺效果。

2）對使用的試管酸浸泡、水龍水直接清洗處理兩種清洗方法，尋找影響大腸埃希菌熒光效果因素。

3）使用北京EC-MUG 培養基陸橋試劑及青島海博EC-MUG 培養基試劑進行比較試驗，檢驗實驗室常規使用的試劑廠家是否優良。

1.材料與儀器

1.1 EC-MUG 培養基，北京陸橋（批號171220）、青島海博（批號20190610）。

1.2 伊紅美蘭培養基，購自北京陸橋有限責任公司。

1.3 培養箱，36℃±1℃;44.5±0.5℃;波長366nm 紫外燈。

2.方法與結果

2.1 方法原理

EC-MUG 培養基檢測大腸埃希氏菌是指:大腸埃希氏菌能特異性產生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)，此酶能分解培養基上的MUG 熒光底物釋放出熒光產物，使培養基在366 nm 紫外光下產生特征性熒光，以此技術來檢測大腸埃希氏菌。

2.2 實驗設計

2.2.1 蒸餾水、酸浸泡分別處理試管，蒸餾水清洗試管組分別分裝蒸餾水（空白對照）、產氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）；酸浸泡試管組分別分裝蒸餾水（空白對照）、產氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）。檢查不同清洗條件下影響實驗熒光效果因素。

2.2.2 北京陸橋、青島海博兩種不同品牌的EC-MUG 培養基，在鑒定產氣腸桿菌（陰性對照）、大腸埃希菌（陽性對照）熒光效果，檢驗兩種不同品牌在檢測大腸埃希氏菌的優劣。

2.3 操作步驟

在總大腸菌群多管發酵法初發酵產酸產氣或產氣的管進行大腸埃希氏菌檢測。用無菌金屬環將前述試管中液體接種到EC－MUG 管中。44.5℃培養24 小時，將培養物在暗處用波長為366nm 功率為6W 的紫外燈照射觀察結果（以下暗室下觀察結果均為366nm 功率為6W 的紫外燈照射觀察）。

2.4 結果

以下結果均為總大腸菌群多管發酵法基礎上，用無菌金屬環將前述試管中液體接種到EC－MUG 管中。44.5℃培養24 小時不同環境條件下的觀察結果。

2.4.1 蒸餾水（空白對照）、產氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）各自對應的蒸餾水清洗試管、酸浸泡過的試管組成兩兩對照熒光觀察結果見表1。

表1 不同清洗條件下，暗室下366nm 功率為6W 的紫外燈照射熒光效果觀察結果

結果說明：（一）蒸餾水清洗的試管及酸浸泡的試管，在各類對照實驗組，他們肉眼觀察實驗現象是沒有差別的。正常的清洗不是影響各組實驗結果的因素。（二）空白組明顯為暗室底色，其他對照組均有明顯的乳白熒光。（三）兩兩熒光效果比較：陽性對照組熒光明亮，陰性組比較暗淡，差別明顯（如圖2）；陰性對照組和干擾組熒光效果無明顯差別（如圖1）。

2.4.2 蒸餾水（空白對照）、產氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）在不同觀察環境下，熒光觀察結果見表2。

表2 不同觀察條件下的實驗熒光效果對照表

結果說明：（一）蒸餾、產氣腸桿菌在44.5℃培養24 小時均為清亮，但沒有混濁，預示沒有細菌繁殖；耐熱大腸菌群、大腸埃希菌液體混濁，44.5℃培養24 小時均有菌生長。（二）產氣腸桿菌與耐熱腸菌桿菌熒光效果一致，大腸埃希菌有區別于其他組別的熒光或顏色反應。（三）、產氣腸桿菌、耐熱大腸菌、均有比較明顯的熒光干擾。應設置空白對照、陽性對照，鑒別陰陽結果（圖1、圖2）。

2.4.3 蒸餾水（空白對照）、產氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）在北京陸橋、青島海博生產的EC－MUG 管實驗結果，熒光觀察見表3。

表3 暗室下366nm 功率為6W 的紫外燈照射熒光效果觀察結果

通過產氣腸桿菌與實驗室耐熱大腸菌群在EC-MUG 高溫培養后的熒光效果比較。產氣腸桿菌在高溫中不能生長，液體清亮，也不能分解熒光底物。

3.討論

3.1 有關文獻及實驗結果中[4]，試管本身會產生微量熒光。本次實驗使用的試管分兩部分，一部分是用酸浸泡試管七天以上，然后進行蒸餾水清洗；另一部分是直接用水龍頭水直接清洗，兩類試管均165℃2 小時以上高溫滅菌。同一菌株在不同方法處置的試管，實驗效果無差別，說明一般試管可能產生的熒光對實驗沒有影響。

3.2 EC-MUG 培養基試劑本身經培養后會溢出一定的熒光物質，如果沒有陽性對照作比較，可能會誤以為是真陽性，造成假陽性結果。因此，初級實驗者或日常工作中，應帶標準菌株同步實驗并觀察實驗結果。

3.3 兩家試劑廠家生產的EC-MUG 培養基，陽性結果產生熒光效果均顯著，實際操作中，日常生活飲用水中的大腸埃希氏菌試驗結果與陰性對照相差無異時，可以按未檢出大腸埃希氏菌結果進行報告。

3.4 GB/T5750.12－2006 檢測大腸埃希氏菌有多管發酵法、濾膜法、大腸埃希氏菌酶底法。推薦的第一法為多管發酵法，采用多管發酵法和酶底物法對大腸埃希氏菌進行檢測，檢出結果基本一致[5]。在日常生活飲用水監測中，第一法相對第二法過濾法更簡便易行；相對第三法酶底法來講，更經濟實惠。因此，第一法多管發酵法，在常規檢測工作中仍是值得推廣的方法。

3.5 不同稀釋度的大腸埃希氏菌液在EC-MUG 培養液中，產生熒光效果無顯著區別。因此，總大腸菌發酵后，在下步實驗操作中，移液管要一管一用，不同發酵管不能出現交叉污染，防止陽性值偏高。