一株羊源無(wú)乳鏈球菌分離鑒定

孟衛(wèi)芹 陳金龍 姚春陽(yáng) 王金良*

（1，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600；2，山東綠都生物科技有限公司 256600）

乳腺炎是奶山羊的常見病和多發(fā)病，會(huì)導(dǎo)致奶產(chǎn)量及品質(zhì)的下降，給奶山羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并給人類公共衛(wèi)生安全帶來(lái)巨大隱患，山東省約1/4 的奶山羊患有乳腺炎，其中大部分為隱性乳腺炎，病原微生物感染及不合理的飼養(yǎng)管理是引起該病的主要病因[1]。引起羊乳房炎的病原微生物眾多，據(jù)報(bào)道有80 多種[2]，金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌及無(wú)乳鏈球菌是引起該病的主要病原菌[3,4]，其中無(wú)乳鏈球菌屬B 群鏈球菌，為重要的人畜共患致病菌之一，可導(dǎo)致嬰幼兒腦炎、敗血癥、肺炎、紅斑狼瘡等嚴(yán)重疾病[5]。筆者用傳統(tǒng)微生物學(xué)分離鑒定和藥敏試驗(yàn)對(duì)該羊場(chǎng)中患病乳腺炎的山羊奶樣進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，并對(duì)分離鑒定出的無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行耐藥性分析，旨在為該羊場(chǎng)無(wú)乳鏈球菌性乳房炎性的治療提供檢測(cè)數(shù)據(jù)的支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

山東省某羊場(chǎng)的疑似無(wú)乳鏈球菌性乳腺炎患病羊所產(chǎn)羊奶。

1.1.2 試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）為OXOID 公司產(chǎn)品；革蘭氏染色液購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；萘啶酸、多黏菌素、結(jié)晶紫購(gòu)自上海華藍(lán)科技有限公司，細(xì)菌DNA 提取試劑盒及Taq DNA 聚合酶預(yù)混液購(gòu)自北京百泰克生物科技有限公司，細(xì)菌微量發(fā)酵管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；鏈球菌選擇性TSA 固體培養(yǎng)基經(jīng)116℃高壓20 min，冷卻到45℃左右后加入無(wú)菌結(jié)晶紫0.2ug/ml、萘啶酸20ug/ml、多黏菌素3ug/ml 及5%的牛血清，普通瓊脂綿羊血平板按常規(guī)方法制備，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 奶樣的采集

采樣前先用溫水洗凈乳房并對(duì)其進(jìn)行消毒處理，消毒后前期采集的乳汁棄掉，盡量無(wú)菌采樣，每個(gè)乳區(qū)收集5～10ml 于無(wú)菌樣品袋中，做好標(biāo)記，奶樣收集完成置于冷藏并立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌的分離

超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌接種環(huán)蘸取奶樣后劃線接種于選擇性TSA平板，于37℃培養(yǎng)24h 后觀察細(xì)菌的分離情況，并對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，對(duì)疑似菌落接種普通瓊脂綿羊血平板觀察有無(wú)溶血現(xiàn)象。

1.2.3 生化試驗(yàn)

將分離菌株分別接種于5%乳糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等糖發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)馬尿酸鈉水解試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)等，37℃培養(yǎng)24h，觀察生化反應(yīng)特性并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 無(wú)乳鏈球菌的PCR 鑒定

1.2.4.1 模版的制備

取細(xì)菌培養(yǎng)物1.5ml，使用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA 存于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 無(wú)乳鏈球菌的PCR 鑒定引物

根據(jù)Radhan[6]等人設(shè)計(jì)的乳腺炎無(wú)乳鏈球菌鑒定引物ST-F:5′-GCTAGGCTCCATTGAATC-3′ P1:5′-GCTAGGCTCCATTGAATC-3′；P2:5′-TTAACCTAGTTTCTTTAAAACTAGAA-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為162bp，并由安徽通用生物有限公司合成。擴(kuò)增片段直接送安徽通用生物有限公司測(cè)序。

1.2.5 無(wú)乳鏈球菌藥敏試驗(yàn)

將分離株細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋后均勻涂布于含5%血清的TSA平板，選取相應(yīng)抗生素的藥敏紙片貼于平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察并判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離

如圖1 可知，37℃培養(yǎng)24h 后在選擇性TSA 平板上形成圓形、灰白色、表面光滑濕潤(rùn)、微凸、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌，成對(duì)或短鏈狀存在。在普通瓊脂綿羊血平板上有溶血現(xiàn)象。

2.2 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)表明，該分離菌發(fā)酵5%的乳糖、海藻糖，不發(fā)酵棉糖、菊糖、山梨醇、甘露醇，馬尿酸鈉水解試驗(yàn)為陽(yáng)性，七葉苷水解試驗(yàn)為陰性，過氧化氫酶試驗(yàn)為陰性，CAMP 試驗(yàn)為陽(yáng)性。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》該分離菌為無(wú)乳鏈球菌。

2.3 無(wú)乳鏈球菌的PCR 鑒定

PCR 鑒定結(jié)果顯示在162bp 位置出現(xiàn)目的條帶（圖2），測(cè)序結(jié)果與NCBI 上公布的無(wú)乳鏈球菌序列同源性在99.8%以上。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)表明分離株對(duì)氟苯尼考、頭孢噻夫、恩諾沙星敏感，而對(duì)環(huán)丙沙星、磷霉素、阿莫西林、慶大霉素、硫酸卡那霉素、新霉素、多西環(huán)素耐藥。

3 討論

山羊乳腺炎多數(shù)為隱性乳房炎，無(wú)明顯的臨床癥狀或病理變化輕微，但在氣溫驟降、飼養(yǎng)管理不善等應(yīng)激條件下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳腺炎，危害嚴(yán)重，目前隱性乳腺炎的治療主要以抗生素治療為主。雖然抗生素在臨床上發(fā)揮了巨大的作用，但在治療中濫用抗生素的情況日益嚴(yán)重，導(dǎo)致抗生素殘留和耐藥菌株的出現(xiàn)，使得治療效果下降，不僅增加治療成本，而且會(huì)導(dǎo)致奶制品品質(zhì)下降。本試驗(yàn)分離臨床無(wú)乳鏈球菌時(shí)，在培養(yǎng)基中添加萘啶酸、多黏菌素和結(jié)晶紫，其中萘啶酸和多粘菌素B對(duì)大腸桿菌、變形桿菌、嗜血桿菌等革蘭氏陰性菌具有抑菌或殺菌作用，結(jié)晶紫可以抑制乳樣中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，大大提高無(wú)乳鏈球菌的分離效率。乳腺炎致病菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)可以篩選出有效的治療藥物，這對(duì)獸醫(yī)臨床上治療羊乳腺炎具有重要的指導(dǎo)作用。