2016～2020年云南部分地區禽腺病毒4型檢測分析

朱麗華 王超 宋建領

（1，云南省玉龍縣龍蟠鄉畜牧產業發展服務中心 674112；2，云南省玉溪市紅塔區動物衛生監督所 653100；3，云南省畜牧獸醫科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室 650224）

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV) 4 型屬于腺病毒科、禽腺病毒屬[1]，為無囊膜、雙股線性DNA 病毒，外形呈立體對稱的二十面體，六鄰體蛋白(Hexon)、五鄰體蛋白(Penton) 和纖維蛋白(Fiber) 構成腺病毒的外殼蛋白。FAdV-4 為禽腺病毒中致病性最強的[2]，是引起近年來在我國爆發的以心包積液和肝炎為主要特征的病毒性傳染病主要病原，給我國養禽業造成巨大的經濟損失。該病1987 年巴基斯坦的安卡拉地區首次爆發該病，所以也稱為安卡拉病，根據典型的臨床特征，又稱為心包積液-肝炎綜合征。1989 年后該病在世界范圍內流行，2013 年在我國散在發生[3]，2015 年在我國大面積爆發[4-6]，2016 年本實驗室在云南省石林縣肉雞群首次檢測到FAdV-4 病原核酸后，每年分別在云南省昆明市、楚雄周、紅河州、玉溪市等家禽養殖密集區采集樣品，進行FAdV-4 流行情況監測，現將2016 年5 月至2020 年4 月份檢測結果報道如下。

1 材料

1.1 病料

2016 年5 月至2020 年4 月在云南省昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市等家禽養殖密集區采集發病雞肝臟樣品，冷藏送實驗室進行檢測。

1.2 主要試劑

DNA 核酸提取試劑盒、PCR 試劑盒和DL2000 分子量標準等均購自大連寶生物公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺（型號為LA2-4A1），購自ESCO 公司；PCR儀（型號為9700），購自美國ABI（Applied Biosystems Inc）公司；凝膠成像系統（型號為2000），購自美國伯樂BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 病料處理

將每個養雞場每次采集的肝臟組織樣品混合剪碎，按1:5的比例加入滅菌PBS 研磨，研磨的混合物反復凍融3 次，3000r/min 離心10min，取上清液提取核酸。

2.2 DNA 的提取

按照DNA 核酸提取試劑盒說明書，分別提取上清液的DNA 核酸。

2.3 PCR 檢測

根據國內外已發表的FAdV-4 病毒基因序列及相關文獻[7]，設計FAdV-4 檢測引物FAdVF:5-TGCTCGTTGTGGATGGTGAA-3、FAdVR:5-CTCCGTGTTGGGCTGGTC-3，預期擴增產物564bp。反應條件為95℃、5min；95℃、45s，58℃、45s，72℃、45s，35 個循環；72℃，10min。1.2%瓊脂糖凝膠，100V 電泳30min，觀察PCR 擴增結果。

3 結果

3.1 樣品采集情況

2016 年5 月至2020 年4 月在云南省昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市等采集樣品290 場次，昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市采集樣品詳細信息見表1。其中土雜雞樣品248 場次，蛋雞42 場次。

3.2 PCR 檢測結果

290 場次樣品，FAdV-4 病毒核酸陽性30 場次，陽性率為10.34%，部分陽性樣品PCR 產物瓊脂糖凝膠結果見圖1。2016年5 月～2020 年4 月每年FAdV-4 核酸檢測結果表明，2020 年1～4 月FAdV-4 感染率最高，2018 年FAdV-4 感染率最低，FAdV-4 核酸檢測陽性詳細情況見表2、圖2。在昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市4 個州市中FAdV-4 感染率最高的是昆明市，FAdV-4 感染率最低的是紅河州，不同區域樣品病原核酸檢測詳細結果見表3、圖3。檢測的290 場次樣品中，土雜雞樣品248 場次，FAdV-4 病毒核酸陽性28 場次，陽性率為11.29%，蛋雞42 場次FAdV-4 病毒核酸陽性2 場次，陽性率為4.76%。

表1 樣品采集情況（單位：場次）

表2 樣品病原核酸檢測結果（單位：場次、%）

表3 不同區域樣品病原核酸檢測結果（單位：場次、%）

4 討論

FAdV-4 感染家禽后發病急傳播快，臨床上主要表現為病雞精神沉郁、腹瀉、消瘦、羽毛蓬松，最后死亡，部分急性病例無明顯臨床癥狀突然死亡。剖檢變化主要為心包有淡黃色積液，透明清亮或呈膠凍樣，肝臟腫大、質地變脆、易碎，有細菌感染的出現肝周炎。2016 年本實驗室在云南省石林縣肉雞群首次檢測到FAdV-4 病原核酸后，至2020 年4 月，檢測290 場次樣品，發現土雜雞和蛋雞均有感染，但土雜雞FAdV-4 感染率明顯高于蛋雞感染率，而且土雜雞感染FAdV-4 后死亡率高于蛋雞感染的死亡率，這與國內報道肉雞死亡率在20%～80%之間，蛋雞死亡率偏低，夏季多發，其他季節也可發生一致[8]。從監測年度看，2016 年首次在云南檢測發現FAdV-4后，2017 年云南省家禽FAdV-4 感染率升高后，2018 年和2019 年南省家禽FAdV-4 感染率維持在一個較低水平，2020 年南省家禽FAdV-4 感染率又進一步升高，據調查發現，云南省2018 養禽場開始使用FAdV-4 疫苗免疫，2018 年和2019 年家禽FAdV-4 感染率低，說明FAdV-4 疫苗免疫能很好控制該病的流行，2020 年FAdV-4 感染率又升高，是由于病毒在免疫壓力下發生了變異還是由于新型冠狀病毒肺炎疫情導致的飼養管理水平降低引起的需要進一步分析。本文檢測結果FAdV-4 感染率最高的是昆明市、感染率最低的是紅河州，可能與昆明市是云南省交通樞紐相關，是云南省禽蛋、飼料交易的中心城市有關，云南省的首例FAdV-4 感染也是在昆明市發現，紅河州在云南省相對處于溫度比較高的區域，不利于FAdV-4 的傳播有關，未見關于云南省FAdV-4 感染區域差異性的相關報道，因此關于云南省FAdV-4 感染區域性差異的原因有待進一步研究。本文檢測到的陽性樣品主要集中在30 日齡左右的土雜雞和開產前蛋雞群，與報道3～5 周齡的肉雞和10～20 周齡蛋雞易感該病一致[9]，對檢測到FAdV-4 陽性雞群，采用高免抗體配合抗生素治療，都取得比較好的治療效果。因此，該病的防控措施除了加強飼養管理和生物安全措施執行到位的同時，主要是在疫區進行疫苗免疫，發病雞群準確診斷后，采取針對性的治療措施都會取得很好的防控效果。