瑞舒伐他汀抑制腦缺血再灌注損傷大鼠P-選擇素表達的研究

陳子卿 許斐凡 王杰華 劉曉東 鄭丁還 張志勇 陳奕虎

【摘要】 目的：探討瑞舒伐他汀對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中P-選擇素的抑制作用。方法：將36只大鼠隨機分為三組，分別為假手術(shù)組、模型組和治療組。除假手術(shù)組外，對其余大鼠復(fù)制腦缺血再灌注模型。治療組在術(shù)前用瑞舒伐他汀連續(xù)灌胃10 d，假手術(shù)組和模型組正常喂養(yǎng)。模型組和治療組于術(shù)后2 h拔出線栓形成再灌注。24 h后應(yīng)用免疫組織化學法、RT-PCR法和Western blotting法檢測三組腦組織中P-選擇素的表達。結(jié)果：模型組P-選擇素表達水平較假手術(shù)組明顯上調(diào)（P<0.05）;治療組P-選擇素表達水平較模型組明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論：瑞舒伐他汀可抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后P-選擇素的表達。

【關(guān)鍵詞】 瑞舒伐他汀 腦缺血再灌注 P-選擇素

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.13.003 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）13-000-03

Inhibiting Effect of Rosuvastatin on the Expression of P-selectin in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion/CHEN Ziqing， XU Feifan， WANG Jiehua， LIU Xiaodong， ZHENG Dinghuan， ZHANG Zhiyong， CHEN Yihu. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（13）： 7-9

[Abstract] Objective： To explore the inhibiting effect of Rosuvastatin on the expression of P-selectin in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion. Method： A total of 36 rats were randomly assigned into three groups， the sham operation group， the model group and the treatment group respectively. The model of cerebral ischemia-reperfusion was replicated in other rats except the sham operation group. Before making a model， the treatment group was lavaged with Rosuvastatin for 10 days continuously， and the sham operation group and the model group received normal feeding. In the model group and the treatment group， the thread was pulled out 2 hours after operation to form a reperfusion. The expression of P-selectin in the brain tissues of the three groups was detected by immunohistochemistry， RT-PCR and Western blotting after 24 hours. Result： The expression levels of P-selectin in the model group were significantly up-regulated compared with those of the sham operation group （P<0.05）. The expression levels of P-selectin in the treatment group were significantly down-regulated compared with those of the model group （P<0.05）. Conclusion： Rosuvastatin can inhibite the expression of P-selectin in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion.

[Key words] Rosuvastatin Cerebral ischemia-reperfusion P-selectin

First-authors address： Huian County Hospital， Huian 362000， China

腦缺血再灌注損傷后病理機制涉及眾多生物活性因子和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與，其中炎癥反應(yīng)起著重要作用[1]。腦缺血再灌注損傷后繼發(fā)的炎性反應(yīng)過程需要細胞黏附分子如P-選擇素的參與，其介導(dǎo)了白細胞的浸潤、黏附血管及穿過血管等過程[2]。瑞舒伐他汀作為一種傳統(tǒng)的降脂藥，具有改善內(nèi)皮功能、抑制炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激等作用[3]。本課題主要觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中P-選擇素的表達情況，并探討瑞舒伐他汀對P-選擇素表達的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

研究時間為2017年6月-2019年3月，選取雄性SD大鼠[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號碼：SCXK（滬）2012-0002]36只，體重250～300 g。隨機分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組12只。

1.2 方法

1.2.1 實驗準備 瑞舒伐他汀（英國阿斯利康制藥公司，生產(chǎn)批號：KF059，規(guī)格：10 mg/片）;P-選擇素兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物有限公司）;即用型免疫組化試劑盒、AEC試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）;Trizol試劑（美國Invitrogen公司）;PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛MBI Fermentas公司）;PCR引物合成（上海生工生物工程技術(shù)公司）;β-actin和辣根酶標記IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;Bradford蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2.2 模型制作 治療組在術(shù)前用瑞舒伐他汀連續(xù)灌胃10 d，劑量為5 mg/（kg·d），1次/d;其余兩組術(shù)前給予同等劑量的生理鹽水，1次/d，共10 d。模型組和治療組復(fù)制腦缺血再灌注模型，采用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉，使其仰臥固定于手術(shù)臺上，于頸部正中做一切口，鈍性分離鼓泡腺，將其上翻并加以保護。分離右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA），結(jié)扎ECA和CCA近心端，于ICA內(nèi)置一動脈夾，于CCA近分叉處剪一約0.2 mm側(cè)“V”形切口，插入栓線，插入深度為（18.5±0.5）mm。使栓線進入ICA，越過大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）開口處，到達大腦前動脈（anterior cerebral artery，ACA）起始部，阻斷MCA的所有血液來源，扎緊備線，甲狀腺復(fù)位，關(guān)閉并縫合皮膚切口[4]。假手術(shù)組接受相似手術(shù)處理，但不插入線栓。術(shù)中，大鼠用小加熱毯進行保溫處理，保持肛溫37 ℃。模型組和治療組于術(shù)后2 h拔出線栓，形成再灌注。術(shù)后24 h后處死所有大鼠，取右側(cè)大腦腦皮質(zhì)備用。

1.2.3 免疫組織化學法檢測P-選擇素的表達 取腦皮質(zhì)組織切片，采用免疫組化SP二步法染色，AEC法顯色，蘇木素復(fù)染。以光學顯微鏡視野（×400倍）觀察組織切片，計算陽性細胞數(shù)。

1.2.4 RT-PCR法檢測P-選擇素mRNA的表達 P-選擇素基因擴增產(chǎn)物大小345 bp、GADPH基因擴增產(chǎn)物大小210 bp。取腦皮質(zhì)組織提取總RNA進行PCR擴增反應(yīng)。結(jié)果以P-選擇素與GADPH的吸光度比值代表基因表達相對水平。

1.2.5 Western blotting法檢測P-選擇素蛋白的表達 取腦皮質(zhì)組織提取蛋白、濃度測定、變性、電泳、轉(zhuǎn)膜封閉，依次進行一抗和二抗的抗原抗體反應(yīng)，顯色、X片顯影、定影。結(jié)果以P-選擇素與β-actin的灰度值比值代表蛋白表達相對水平。

1.3 觀察指標

對比三組P-選擇素表達情況。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

假手術(shù)組未見P-選擇素表達。模型組P-選擇素陽性血管數(shù)、mRNA和Western蛋白印跡表達水平均顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療組P-選擇素陽性血管數(shù)、mRNA和Western蛋白印跡表達水平均顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1、圖1、圖2、圖3。

3 討論

腦缺血再灌注損傷后往往伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。P-選擇素作為炎癥反應(yīng)過程中的重要因子，可介導(dǎo)多形核細胞聚集并黏附于血管內(nèi)皮上，加重腦組織微循環(huán)障礙[5]。P-選擇素在生理情況下表達極少，但在血栓形成、炎性反應(yīng)等病理過程中可發(fā)揮重要作用。臨床研究顯示，P-選擇素表達水平在腦梗死患者中明顯上升[6];基礎(chǔ)研究顯示，P-選擇素可促進小鼠腦梗死面積的擴大，加重神經(jīng)功能缺損[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腦皮質(zhì)中P-選擇素的表達水平較假手術(shù)組顯著升高（P<0.05），與以往報道一致，提示P-選擇素在腦損傷的病理過程中具有重要作用，可在一定程度上反映急性腦缺血損傷的嚴重程度。有研究表明，通過對P-選擇素水平進行動態(tài)檢測有利于診斷早期急性腦梗死患者類型，可為臨床采取相應(yīng)的診療措施以防止病情惡化提供參考，從而降低患者的致殘率和病死率[8]。

他汀類藥物為臨床常用降脂藥，具有顯著的抗動脈粥樣硬化作用。除此之外，他汀類藥物還具有抗炎、抑制細胞凋亡、抑制血小板聚集等多重效應(yīng)[9-10]。瑞舒伐他汀作為強效調(diào)脂藥，相對其他降脂藥而言，具有更好的安全性和耐受性。筆者在以往的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可通過調(diào)節(jié)缺血區(qū)腦組織炎性因子的水平而起到神經(jīng)保護作用[11-12]。本實驗中，通過對模型組和治療組進行對比，進一步顯示，治療組腦皮質(zhì)中P-選擇素的表達水平較模型組下調(diào)（P<0.05），表明瑞舒伐他汀能夠有效抑制P-選擇素的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

參考文獻

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（收稿日期：2019-12-19） （本文編輯：李盈）