廣藿香百秋李醇分子調(diào)控及合成生物學(xué)研究進(jìn)展

張嬋 姚廣龍 張軍鋒 于靖 楊東梅 陳萍 吳友根

（海南大學(xué)園藝學(xué)院，海口 571100）

廣藿香（Pogostemon cablin）是一種藥用芳香類草本植物，為首批“嶺南地道藥材保護(hù)品種”之一。其主要在印度尼西亞、新加坡、越南、馬來(lái)西亞、中國(guó)等地區(qū)種植［1］。廣藿香油是以廣藿香干燥地上部分經(jīng)蒸餾等方式加工而成［2］。廣藿香油的作用主要有兩類，一是其具備抑菌、消炎、止痛、抗抑郁、抗血小板、抗胃潰瘍、抗光老化等17種藥理功 效［3-6］，可入藥；二是其香味獨(dú)特且定香功能顯著，可作為香料和食品添加劑［7］。得益于其效用，廣藿香油在日化用品、藥品和食品等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)前景廣闊［7-8］。優(yōu)質(zhì)的廣藿香油價(jià)格可高達(dá)1 300元/kg，就零售價(jià)而言，其可在全球重要精油中排名第十，經(jīng)濟(jì)效益明顯［9-10］。

百秋李醇（patchoulol）是一種倍半萜，為廣藿香油中的含量最多的組分之一，于1869年以白色晶體形式被分離鑒定［7，11-12］。百秋李醇是《中國(guó)藥典》中評(píng)價(jià)廣藿香及其精油質(zhì)量的重要指標(biāo)，也被認(rèn)為是廣藿香油藥理功效和香味的主要貢獻(xiàn)成分［6］。目前，全球百秋李醇及其混合精油年產(chǎn)量約1 300 t，但年需求量可達(dá)2 000 t，供不應(yīng)求。其中90%的產(chǎn)量由印度尼西亞供應(yīng)，而中國(guó)的產(chǎn)量不到10%，上升空間極大［10，13］。提高百秋李醇的產(chǎn)量成為廣藿香研究中的重點(diǎn)。為此，本文將從百秋李醇的合成途徑、分子調(diào)控機(jī)制和合成生物學(xué)工程三方面綜述近年來(lái)的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 百秋李醇生物合成途徑及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

1.1 生物合成途徑

在廣藿香中，與百秋李醇合成相關(guān)的途徑主要有兩條，一是定位于細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑，二是定位于葉綠體的甲基赤蘚糖-4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate，MEP）途徑，兩者均可產(chǎn)生異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），IPP可與DMAPP反應(yīng)生成法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）、牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）和牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）等合成萜類化合物的直接前體物質(zhì)［14］。一般情況下，百秋李醇主要是由MVA途徑產(chǎn)生的FPP為前體合成的（圖1）［15］。百秋李醇合成后有兩條去路，一是以混合精油形式在廣藿香花、根、莖、葉的特定細(xì)胞中存儲(chǔ)［16］；二是以揮發(fā)物形式釋放到外界環(huán)境。

在百秋李醇的合成中有6個(gè)關(guān)鍵酶（圖1），分別為乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶（PatAACT）、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶（PatHMGS）、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（PatHMGR）、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（PatIPI）、法呢基焦磷酸合酶（PatFPS）和百秋李醇合酶（PatPTS）等，其中后4個(gè)酶已被克隆并進(jìn)行了功能驗(yàn)證（表1）。唐云等［17］和盧昌化等［18］構(gòu)建了pCAMBIA1304-PatFPS和pR101-PatPTS的雙元表達(dá)載體發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PatFPS和PatPTS可促進(jìn)百秋李醇的合成；Yan等［19］和Zhang等［20］分別構(gòu)建了基因沉默載體pTRV2-PatIPI和過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-PatHMGR發(fā)現(xiàn)，沉默PatIPI會(huì)顯著降低百秋李醇含量，而過(guò)表達(dá)PatHMGR則使百秋李醇含量顯著增多；以上研究表明PatHMGR、PatIPI、PatFPS和PatPTS參與百秋李醇的生物合成。

表1 廣藿香百秋李醇合成途徑中已經(jīng)克隆的酶Table 1 Enzymes cloned in the synthetic pathway of patchoulol in P. cablin

1.2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子可影響酶基因表達(dá)的特異性、時(shí)空性和高效性，故其在百秋李醇的合成中也具有重要作用。轉(zhuǎn)錄因子是一種DNA結(jié)合蛋白，常與順式元件結(jié)合以調(diào)控基因的表達(dá)。迄今，與百秋李醇生物合成調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有6類，包括MYB家族（1個(gè)）、bHLH家族（2個(gè)）、SPL家族（1個(gè)）和TH家族（1個(gè)）。

MYB是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控；Chen等［27］發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核PatMYB46（PatSWC4），可與PatJAZ4結(jié)合調(diào)控PatPTS的表達(dá)，過(guò)表達(dá)PatMYB46可顯著上調(diào)百秋李醇生物合成途徑中所有酶基因的表達(dá)水平，從而提高百秋李醇的含量。MYC轉(zhuǎn)錄因子是bHLH家族中的一個(gè)亞類；Wang等［28］發(fā)現(xiàn)PatMYC2b1和PatMYC2b2均可與PatJAZ6結(jié)合影響PatPTS的表達(dá)水平，但該研究更側(cè)重對(duì)PatJAZ6的研究，并沒有對(duì)PatMYC2b1和PatMYC2b2的生物學(xué)特征進(jìn)行系統(tǒng)分析。TH家族是與光反應(yīng)調(diào)控相關(guān)一類轉(zhuǎn)錄因子；Li等［29］發(fā)現(xiàn)廣藿香中的16個(gè)PatTH的組織表達(dá)模式有所不同，PaTH1，4，7，8，9，15在葉中表達(dá)最高，PatTH3和PatTH6則分別主要在莖和根中表達(dá)；進(jìn)一步分析表明PatGT-1可與PatHMGR的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制其表達(dá)；且在廣藿香中過(guò)表達(dá)PatGT-1會(huì)抑制百秋李醇合成途徑所有酶的表達(dá)，從而抑制百秋李醇的合成［29］。SPL是植物特有轉(zhuǎn)錄因子家族，其最大的特征是具備miRNA156/157識(shí)別位點(diǎn)，miRNA156/157可通過(guò)mRNA剪切或翻譯抑制等作用，調(diào)控SPL基因的表達(dá)水平；Yu等［30］發(fā)現(xiàn)SPL10可調(diào)控廣藿香中PatPTS的表達(dá)，以促進(jìn)百秋李醇的合成，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SPL10（At1g27370）可顯著提高百秋李醇的含量。此外，與廣藿香相關(guān)還有WRKY家族；唐云等［31］克隆了PatWRKY40和PatWRKY53兩個(gè)基因；其中PatWRKY40在廣藿香中的表達(dá)具有組織表達(dá)差異性，在葉中表達(dá)量最高，其次為花和莖；但對(duì)于兩者是否參與百秋李醇的合成調(diào)控還不清楚。

轉(zhuǎn)錄因子可激活特定代謝通路中多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá)，改造轉(zhuǎn)錄因子提高藥用植物中活性物質(zhì)產(chǎn)量的方法，可彌補(bǔ)單個(gè)基因或多個(gè)基因改造后出現(xiàn)的效果不足、甚至致死的現(xiàn)象［32］。系統(tǒng)了解與百秋李醇生物合成相關(guān)酶及轉(zhuǎn)錄因子的作用，對(duì)提高廣藿香中百秋李醇含量具有重要意義。

2 百秋李醇分子調(diào)控機(jī)制

百秋李醇本質(zhì)上是一種倍半萜，其合成主要受兩方面因素的調(diào)控，一是生物因素，包括發(fā)育階段、組織特異性等；二是非生物因素，如外源植物激素、晝夜節(jié)律、溫度和礦質(zhì)因子等。本部分將重點(diǎn)介紹外源植物激素、發(fā)育階段與晝夜節(jié)律等調(diào)控百秋李醇合成的分子機(jī)制。

2.1 外源植物激素調(diào)控百秋李醇合成

外源植物激素是人為施加，可在一定范圍內(nèi)促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程的有機(jī)化合物。在廣藿香研究中涉及過(guò)5種植物激素［27］，包括茉莉酸類、脫落酸、乙烯、水楊酸和赤霉素，其中以茉莉酸類的研究最為深入。茉莉酸類物質(zhì)（jasmonates，JAs）主要包括茉莉酸和茉莉酸甲酯（methyl-jasmonate，MeJA）等，在茉莉酸信號(hào)通路中作為信號(hào)分子發(fā)揮作用［33］。當(dāng)外界脅迫發(fā)生后，JAs可迅速合成并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，與抑制子JAZ（jasmonate ZIM domain protein）和E3泛素化酶SCFCOI1組成的共接受子結(jié)合，引起JAZ蛋白的泛素化降解，釋放與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活或抑制次生代謝產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)［34］。

多項(xiàng)研究表明JAs可調(diào)控廣藿香百秋李醇的生物合成。何夢(mèng)玲等［35］率先發(fā)現(xiàn)MeJA可促進(jìn)廣藿香中百秋李醇的合成。Chen等［36］發(fā)現(xiàn)MeJA可上調(diào)PatHMGR1和PatHMGR2（MAV途徑）、PatDXS和PatHDR（MEP途徑）以及PatPTS等基因的表達(dá)。Tang等［14］發(fā)現(xiàn)以MeJA處理6 h，可顯著上調(diào)PatATCC、PatHMGR、PatMVD、PatFPS等4個(gè)基因的表達(dá)水平，且百秋李醇的含量顯著增多。但要注意，不同的處理時(shí)間產(chǎn)生的結(jié)果有差異。如Li等［30］以MeJA處理12 h后，會(huì)上調(diào)PatGT-1的表達(dá)水平。

JAZ蛋白通常作為茉莉酸信號(hào)通路中的抑制子，在JAs調(diào)控的百秋李醇合成中具有重要作用。Chen等［36］發(fā)現(xiàn)MeJA可顯著上調(diào)PatJAZ2，3，4，6，11等5個(gè)基因的表達(dá)，或與百秋李醇的含量增多相關(guān)。Wang等［29］在廣藿香中過(guò)表達(dá)PatJAZ6，可抑制PatPTS、PatMYC2b1、PatMYC2b2的表達(dá)；深入分析發(fā)現(xiàn)PatJAZ6可與PatMYC2b1或PatMYC2b2結(jié)合，負(fù)調(diào)控PatPTS的表達(dá)，而MeJA可與PatJAZ6結(jié)合，使其在SCFCOI1的作用下泛素化，隨后被26S蛋白酶體降解，釋放PatMYC2b1和PatMYC2b2，激活PatPTS的表達(dá)（圖1）。近期，Chen等［27］發(fā)現(xiàn)PatJAZ4可與PatMYB46結(jié)合，負(fù)調(diào)控PatPTS的表達(dá)，而MeJA也可逆轉(zhuǎn)其負(fù)調(diào)控效果（圖1）。鄧靜文等［37］研究表明PatJAZ2是響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)百秋李醇合成的主要順式元件，其可激活倍半萜合成途徑PatFPS基因的協(xié)同表達(dá)，影響百秋李醇的合成情況。

圖1 廣藿香百秋李醇合成途徑與分子調(diào)控模式圖［27-30］Fig. 1 Synthetic pathway and molecular regulation model of patchoulo in P. cablin［27-30］

綜上可知，植物激素MeJA調(diào)控百秋李醇的機(jī)制主要有兩方面：一是調(diào)控百秋李醇合成途徑PatHMGR、PatFPS、PatIPI等基因的表達(dá)，促進(jìn)前體物質(zhì)的合成，間接影響百秋李醇的合成；二是通過(guò)影響相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子與抑制子的結(jié)合情況，調(diào)控PatPTS的表達(dá)，直接影響百秋李醇的合成。但以上研究中均以葉片中存儲(chǔ)的百秋李醇作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，忽略了釋放到環(huán)境中的百秋李醇，這或?qū)σ延薪Y(jié)果造成一定的影響。

2.2 晝夜節(jié)律與發(fā)育階段調(diào)控百秋李醇合成

廣藿香百秋李醇的合成具有時(shí)間特異性，主要在兩方面展現(xiàn)，一是晝夜節(jié)律性（短期），即在同一天的不同時(shí)刻產(chǎn)生的規(guī)律變化；二是發(fā)育階段性（長(zhǎng)期），即隨不同生長(zhǎng)時(shí)期而產(chǎn)生規(guī)律的變化。劉璐等［38］發(fā)現(xiàn)百秋李醇的合成受晝夜變化的影響，廣藿香中百秋李醇的含量分別于00：00和12：00達(dá)到最低和最高；從00：00到06：00點(diǎn)，其含量先急劇上升后下降；從12：00到21：00點(diǎn)則相反。羅集鵬等［39］和Yu等［28］檢測(cè)到廣藿香葉片和莖中的百秋李醇含量會(huì)隨著生長(zhǎng)期推進(jìn)而增加。

百秋李醇合成受發(fā)育階段調(diào)控的現(xiàn)象，在不同組織中保守程度也有所差異。Quyang等［40］發(fā)現(xiàn)葉片中百秋李醇合成受發(fā)育階段調(diào)控的現(xiàn)象，在中國(guó)和印度尼西亞兩個(gè)品種之間是相對(duì)保守的，而莖中該現(xiàn)象在兩個(gè)品種之間卻有所變化，表明發(fā)育階段調(diào)控的百秋李醇合成受品種和組織特異性的影響。SPL是調(diào)控植物生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，Yu等［28］發(fā)現(xiàn)在廣藿香中過(guò)表達(dá)SPL10（At1g27370）可顯著提高百秋李醇的含量，而過(guò)表達(dá)miRNA156則相反（圖1），這表明miRNA156與SPL轉(zhuǎn)錄因子參與百秋李醇的合成調(diào)控。miRNA156可抑制SPL的表達(dá)，這可能是出現(xiàn)過(guò)表達(dá)miRNA156和SPL10效果不同的原因。

綜上，發(fā)育階段和晝夜節(jié)律可調(diào)控廣藿香百秋李醇的生物合成，且受栽培品種和組織特異性的影響，而miRNA156靶標(biāo)的SPL10在發(fā)育階段調(diào)控百秋李醇的生物合成中具有重要作用。但該研究中使用的SPL10是擬南芥At1g27370，對(duì)于廣藿香中SPL轉(zhuǎn)錄因子在百秋李醇合成調(diào)控中的作用仍不清楚。

3 百秋李醇的合成生物學(xué)工程

百秋李醇的獲取主要有兩種方式，一是從廣藿香中天然萃取，二是以合成生物學(xué)工程生產(chǎn)。植物提取法效率低、產(chǎn)量少、穩(wěn)定性差，不能滿足市場(chǎng)需求，合成生物學(xué)工程生產(chǎn)萜類化合物效率高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保且供應(yīng)穩(wěn)定性好，成為了獲取百秋李醇的熱門手段。本部分將從以下3方面介紹近年來(lái)百秋李醇合成生物學(xué)的相關(guān)進(jìn)展。

3.1 不同來(lái)源底盤細(xì)胞的構(gòu)建

底盤細(xì)胞的構(gòu)建是異源合成百秋李醇的第一步。底盤細(xì)胞是參照工程學(xué)理念置入特定功能的人工生物系統(tǒng)。迄今，可用于合成百秋李醇的底盤細(xì)胞有7種，包括微生物（釀酒酵母、谷氨酸棒桿菌、莢膜紅螺菌）和植物（煙草、萊茵衣藻、小立碗蘚、地錢）（表2）。

表2 用于合成百秋李醇的7種生物底盤Table 2 Seven biological chassis used to synthesize patchoulol

3.1.1 微生物來(lái)源的底盤細(xì)胞構(gòu)建 釀酒酵母是最早用來(lái)生產(chǎn)百秋李醇的底盤細(xì)胞，其構(gòu)建策略主要可分為以下4方面［51］：一是過(guò)表達(dá)MVA途徑關(guān)鍵酶，增加前體物質(zhì)FPP的供應(yīng)；二是替換基因元件的啟動(dòng)子，下調(diào)其他競(jìng)爭(zhēng)通路；三是敲除負(fù)調(diào)控因子，抑制非目標(biāo)產(chǎn)物；四是過(guò)表達(dá)百秋李醇合酶（PatPTS）。已有報(bào)道中，常同時(shí)采用上述多個(gè)策略構(gòu)建底盤生產(chǎn)百秋李醇。Asadollahi等［44］將MET3替換角鯊烯合酶（ERG9）的啟動(dòng)子，減少FPP流向其他通路，卻使法尼醇合成增多，以致百秋李醇產(chǎn)量提高不明顯。Gruchattka等［42］敲除釀酒酵母丙酮酸脫氫酶旁路中的α-酮戊二酸脫氫酶，增加檸檬酸循環(huán)轉(zhuǎn)向萜類的代謝通量，過(guò)表達(dá)FPS（ERG20）和tHMGR（源自酵母）后，百秋李醇產(chǎn)量提高明顯，達(dá)41.6 mg/L。Ma等［9］首先將tHMGR、IPI和upc2-1整合到酵母基因組，增強(qiáng)MVA代謝通路；然后以HXT1弱化角鯊烯合酶（ERG9）的表達(dá)，敲除編碼焦磷酸酶的DPP1和LPP1；并調(diào)整葡萄糖濃度以控制百秋李醇和角鯊烯代謝流，使百秋李醇產(chǎn)量達(dá)466.8 mg/L，是已有報(bào)道中最高的。

莢膜紅螺菌和谷氨酸棒桿菌是合成百秋李醇的新型細(xì)菌底盤，二者沒有MVA途徑，因此必須重構(gòu)法尼基焦磷酸合成模塊，才能合成百秋李醇。Troost等［45］在Rhodobacter capsulatus SB1003中加入nifHDK操縱子的Pnif啟動(dòng)子，使重組表達(dá)模塊僅在光照和銨耗竭的情況下被誘導(dǎo)；后構(gòu)建包含1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP）模塊，甲羥戊酸通路（MVA）模 塊（源 自Paracoccus zeaxanthinifaciens）和異戊二烯基磷酸酯（IDI）模塊（源自Rhodobacter sphaeroides）的工程菌Rhodobacter capsulatus SB1003-MAV，過(guò)表達(dá)3個(gè)模塊中的限速酶DXS、IDI、IspA基因后，百秋李醇的產(chǎn)量被提高了126倍，該研究首次在細(xì)菌中建立可嚴(yán)格控制的光反應(yīng)平臺(tái)。crtE和idsA是谷氨酸棒桿菌GGPP的編碼基因，Henke等［2］構(gòu)建了ΔcrtEΔidsA谷氨酸棒桿菌，并重構(gòu)法尼基焦磷酸合成模塊，異源表達(dá)大腸桿菌的法尼基焦磷酸合酶基因（ispAEc）和PatPTS，百秋李醇產(chǎn)量達(dá)60 mg/L。谷氨酸棒桿菌和莢膜紅螺菌主要是通過(guò)質(zhì)粒驅(qū)動(dòng)異源表達(dá)，尚未見將反應(yīng)元件整合至DNA中的報(bào)道。

3.1.2 植物來(lái)源的底盤細(xì)胞構(gòu)建 煙草是最早用于合成百秋李醇的植物底盤，而萊茵衣藻、小立碗蘚和地錢3種低等植物是合成百秋李醇的新型底盤，四者特點(diǎn)見表2。Wu等［46］將PatPTS和FPS在煙草葉綠體中靶向表達(dá)，率先實(shí)現(xiàn)以煙草合成百秋李醇，但該研究側(cè)重的是提高煙草抗蟲性，對(duì)以其生產(chǎn)百秋李醇方面并未深入研究。Lauersen等［47］使用核基因改造的新策略，在潮霉素抗性載體轉(zhuǎn)基因的萊茵衣藻基礎(chǔ)上，將3個(gè)拷貝（3X）PatPTS基因整合至DNA上，百秋李醇的產(chǎn)率是1XPatPTS核轉(zhuǎn)基因底盤的4倍。Zhan等［49］率先在小立碗蘚中非靶向表達(dá)PatPTS，過(guò)表達(dá)tHMGR（源自小立碗蘚），百秋李醇產(chǎn)量達(dá) 59 μg/g CDW；小立碗蘚僅含兩個(gè)二萜合酶編碼基因CPS/KS，但Zhan等［49］發(fā)現(xiàn)敲除CPS/KS并不能提高百秋李醇的合成。周璐等［50］分別將強(qiáng)啟動(dòng)子35S和CVM與FPS（源自地錢）和PatPTS連接，在地錢中共表達(dá)兩個(gè)基因后，百秋李醇產(chǎn)量為655.21 μg/g CDW，是植物底盤中報(bào)道最高的。

植物底盤細(xì)胞具有調(diào)控系統(tǒng)精密、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等特點(diǎn)，但以其為底盤生產(chǎn)百秋李醇的產(chǎn)量較低且提高幅度慢。目前，在微生物底盤中，釀酒酵母已可生產(chǎn)商用的百秋李醇，但該產(chǎn)品為瑞士Firmenich公司所擁有［52］；而在植物底盤中，地錢的潛力最大，但其產(chǎn)量仍未達(dá)到商業(yè)化的要求。

3.2 合成元件的設(shè)計(jì)和組裝

合成元件的設(shè)計(jì)和組裝是實(shí)現(xiàn)百秋李醇異源合成的第二步，該部分的研究?jī)?nèi)容可分為兩方面：一是合成元件的設(shè)計(jì)，即基因元件密碼子的優(yōu)化。如Henke等［2］、Troost等［45］和Asadollahi等［44］均 對(duì)PatPTS的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其能在谷氨酸棒桿菌、莢膜紅螺菌和釀酒酵母中異源表達(dá)。Zhan等［49］在小立碗蘚中，以35S啟動(dòng)子控制HMGR的表達(dá)。Mitsui等［41］以S. cerevisiae和Hansenula polymorpha中15個(gè)啟動(dòng)子等對(duì)MVA途徑中的6個(gè)關(guān)鍵酶的啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化。二是設(shè)計(jì)合成元件組合模式，即優(yōu)化不同基因元件的組合方式。如Lauersen等［47］在萊茵衣藻中共表達(dá)PatPTS和FPP、PatPTS和ispAEc、PatPTS和FPP，以PatPTS和ispAEc的表達(dá)效果最好。Wu等［46］比較了2tpPatPTS、2tpFPSPatPTS、2tpPatPTS-tpFPS靶向煙草葉綠體后百秋李醇的合成情況，效果最好的是2tpPatPTStpFPS。Troost等［45］評(píng) 估 了PatPTS-IspA、PatPTSDXS、PatPTS-idi、PatPTS-MVA、PatPTS-ispA-dxs、PatPTS-ispA-dxs-idi、PatPTS-ispA-dxs-idi-MVA等不同組合生產(chǎn)百秋李醇的效果，其中雙基因組合PatPTSIspA和多基因組合PatPTS-ispA-dxs-idi的產(chǎn)量分別是對(duì)照的96倍和115倍，效果最佳。

3.3 合成反應(yīng)的優(yōu)化和提升

合成反應(yīng)的優(yōu)化和提升是實(shí)現(xiàn)百秋李醇異源生產(chǎn)的最后一步。目前，百秋李醇合成生物學(xué)工程中主要采用了4種優(yōu)化策略。

3.3.1 關(guān)鍵酶基因元件的優(yōu)化 百秋李醇合成通路中具有多個(gè)關(guān)鍵酶基因，這些元件可通過(guò)基因替換、基因元件擴(kuò)增、基因融合表達(dá)、基因簇整合及與耐藥元件組合等方式進(jìn)行優(yōu)化。如Lauersen等［47］構(gòu)建了PatPTS-CFP（mCerulean3抗性基因）和PatPTS-YFP（黃色熒光蛋白）的雙重表達(dá)系統(tǒng)，使百秋李醇產(chǎn)量增加了3倍；此外，其還在萊茵衣藻中表達(dá)了3XPatPTS的融合載體，使產(chǎn)量提高4倍［47］。

3.3.2 增加前體底物FPP的供應(yīng)量 FPP可合成百秋李醇、角鯊烯或法呢醇，抑制FPP的其他代謝通路，可增加其流向百秋李醇的總量。Asadollahi等［44］抑制角鯊烯合酶編碼基因ERG9的表達(dá)后，百秋李醇的產(chǎn)量增多。Henke等［2］敲除idsA和crtE，減少DMAPP合成GGPP，促進(jìn)百秋李醇的合成。

3.3.3 引入亞細(xì)胞靶向表達(dá) MVA和MEP途徑分別在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體形成不同的萜類前體池，對(duì)基因元件的靶向表達(dá)，可提高FPP的利用效率。如周璐等［50］分別在FPS和PatPTS的5'端加入RUBISCO蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽信號(hào)序列，使其在地錢葉綠體中靶向表達(dá)，百秋李醇的產(chǎn)量顯著增加。Peramuna等［48］在小碗立蘚中，構(gòu)建了3種細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)滴蛋白基因與PatPTS共表達(dá)的底盤，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)定位表達(dá)的細(xì)胞中百秋李醇的保留量得到顯著提高，但百秋李醇的產(chǎn)量并未增加。目前，靶向表達(dá)的策略主要針植物底盤，在微生物底盤中開展較少。

3.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化 優(yōu)化發(fā)酵方式和培養(yǎng)基組成，均可提升百秋李醇的產(chǎn)量。Henke等［2］發(fā)現(xiàn)分批補(bǔ)料發(fā)酵比的震蕩培養(yǎng)效果更好。Lauersen等［47］發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻利用不同碳源生產(chǎn)百秋李醇效果不同，以CO2、乙酸鹽、CO2加乙酸鹽為唯一碳源時(shí)，百秋李醇濃度分別為351 μg/L、363 μg/L以及435 μg/L，同時(shí)添加CO2和乙酸鹽的效果最佳。

4 展望

廣藿香中百秋李醇含量低，是限制其規(guī)?；_發(fā)與利用的關(guān)鍵。利用合成生物學(xué)工程生產(chǎn)百秋李醇，不受環(huán)境和土地面積的制約，可穩(wěn)定百秋李醇的價(jià)格及供應(yīng)情況，農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值高；而了解百秋李醇合成途徑及分子調(diào)控機(jī)制，可為合成生物學(xué)工程的開展奠定基礎(chǔ)；雙管齊下，才有望解決百秋李醇供不應(yīng)求的問題。結(jié)合當(dāng)前研究現(xiàn)狀，對(duì)未來(lái)研究方向提出以下幾點(diǎn)建議。

4.1 系統(tǒng)分析百秋李醇生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

目前，廣藿香中已鑒定的轉(zhuǎn)錄因子僅針對(duì)PatPTS、PatHMGR兩個(gè)酶，與其他關(guān)鍵酶互作的轉(zhuǎn)錄因子仍然未知；轉(zhuǎn)錄因子的活性可受磷酸化、乙酰化修飾及互作蛋白的影響，但在該方面尚未見的相關(guān)報(bào)道；深入了解轉(zhuǎn)錄因子，有助于解析百秋李醇的分子調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)其合成生物學(xué)工程的開展。

4.2 解析激素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在百秋李醇合成中的作用

百秋李醇的合成與上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的密不可分。百秋李醇受茉莉酸信號(hào)的調(diào)控，其他激素信號(hào)（如乙烯、脫落酸、水楊酸等）在百秋李醇生物合成中的作用仍不清楚，這些信號(hào)可否交叉調(diào)控百秋李醇的生物合成。萜類物質(zhì)的合成受多種因素的影響，因此，有必要揭示其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

4.3 建立百秋李醇合成的可控人工生物系統(tǒng)

利用環(huán)境信號(hào)（光、溫度）與內(nèi)源信號(hào)（群體感應(yīng)、壓力）建立可嚴(yán)格控制的人工生物系統(tǒng)，是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)；尋找更高產(chǎn)的底盤細(xì)胞，設(shè)計(jì)更高效反應(yīng)元件裝配組合，提高元件、裝置、和底盤之間的適配性有助于提高百秋李醇產(chǎn)量；可結(jié)合兩方面內(nèi)容深入研究。