雌激素受體β拮抗劑對非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響*

信 波，張開亮△，宋曉鵬，李海波，賈 麗，龐海林

1.解放軍第960醫院泰安醫療區(泰安 271000)；2.空軍軍醫大學唐都醫院腫瘤科(西安 710038)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，也是與腫瘤相關死亡的主要原因。2018年，全球新診斷腫瘤病例1800萬例，其中肺癌占新發腫瘤的11.6%，占腫瘤相關死亡的18.4%[1]。肺癌在病理學上大致可分為非小細胞肺癌(Mon-small cell lung cancer， NSCLC),和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占肺癌的85%以上[2]。總體而言，大約20%的NSCLC患者早期(Ⅰ期和Ⅱ期)，30%為局部晚期(Ⅲ期)，50%已有轉移(Ⅳ期)。近些年，由于診斷技術的進步、體檢普及的提高，越來越多的早期 NSCLC 患者被發現，但大部分 NSCLC 患者在就診時即為中晚期，其五年內生存率僅 15%左右。而發生轉移的 NSCLC 大多預后不佳，部分患者可行根治性手術治療，大部分晚期患者多需行傳統的放化療治療，但其治療效果欠佳[3]。近些年興起的靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療，也最終將不可避免的發生耐藥。

雌激素是一類重要的維系人類性征和生理功能的類固醇性激素；近年來，發現雌激素在炎癥、腫瘤、心血管疾病、代謝病、神經系統疾病、骨質疏松多種病理過程中也發揮了不可忽視的作用[4]。雌激素主要通過雌激素受體(Estrogen receptor，ER)發揮這些作用，而ER主要分為 ERα 和 ERβ 兩類[5]。ER屬于核受體超家族，以多種方式發揮生物學功能。在經典的基因組反應中，一旦雌激素與其結合將導致構象變化，ERs就會形成二聚體，并移位到細胞核，與雌激素反應元件或其他轉錄因子相互作用，并招募共激活因子來調節靶基因的轉錄。除此之外，ER還可以激活非細胞核信號轉導途徑，這在多種細胞類型中也被稱為快速/非基因組/膜啟動的類固醇信號途徑[6]。

近年來，在肺癌發生發展中，雌激素所起的作用受到了廣泛關注。已有文獻報道，與正常肺細胞相比，NSCLC組織中存在有大量ER[7-8]。人體內雌激素主要為雌二醇(E2)，前期我們的研究已證實了E2通過雌激素 β 受體促進非小細胞肺癌A549細胞增殖[9]、遷移和侵襲。那么，拮抗雌激素受體β后會對A549細胞增殖、遷移和侵襲能力產生怎樣的影響呢？因此，本實驗旨在進一步明確雌激素受體β在體外對人非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為其臨床應用提供理論及實驗依據。

材料和方法

1 實驗材料 人類非小細胞肺癌細胞系A549購自中科院上海細胞生物研究所；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；雌激素受體β拮抗劑(4-[2-Phenyl-5,7-bis(trifluoromethyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]phenol,PHTPP)、雌激素受體β激動劑(2,3-Bis(4-hydroxyphenyl)-propionitrile,DPN)購自英國TOCRIS公司；Tranwell小室購自美國MILLIPORE公司；Matrigel基質膠購自美國BD Corning公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒、結晶紫染色液均購自上海碧云天生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養：常規使用RPMI-1640培養液(含10% FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素)培養人非小細胞肺癌細胞系A549細胞。取對數生長期的細胞進行實驗。

2.2 細胞增殖實驗：將A549細胞分成五組，五種不同濃度PHTPP分別作用24 h和48 h。取生長至鋪滿瓶底80%左右的A549細胞，常規消化；按每孔1000個細胞的密度將細胞接種至96孔板，為了去除胎牛血清中可能存在的激素所帶來的影響，待細胞貼壁后，換無血清培養基培養24 h，而后在96孔板內按濃度梯度(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)加入PHTPP，每個濃度設立5個復孔；“十字形”晃動培養板，使細胞分布均勻，放入培養箱；加入相關試劑后的第24 h和48 h分別用MTT法檢測細胞的增殖情況，并分析得出的數據。

2.3 平板克隆形成實驗：將處于對數生長期的A549細胞用胰酶消化，重懸后制成單細胞懸液；于6孔板培養板中接種200個細胞/孔，分為3個實驗組和1個對照組，每組3個復孔，見表1。將接種好的細胞于培養箱中繼續培養到6 d，為了去除胎牛血清中可能存在的激素所帶來的影響，換無血清培養液培養24 h。而后在無血清培養液中加入相應濃度的試劑培養48 h，后換新鮮完全細胞培養液繼續培養5 d。待肉眼可見克隆形成或鏡下可觀察到絕大多數單克隆中細胞數大于50個為止(中途每3 d進行換液并觀察細胞狀態)。后每孔加入95%酒精1 ml，固定細胞20 min；PBS漂洗細胞1次；每孔加入1%結晶紫染液1 ml，染細胞15 min；將六孔板浸泡至流水中洗滌，直至洗凈板上背景，晾干；數碼相機拍照整張板，并對肉眼可見克隆進行計數。

表1 平板克隆形成實驗分組

2.4 體外侵襲和遷移實驗

2.4.1 侵襲實驗：分組同平板克隆形成實驗。取對數生長期的A549細胞，為了去除胎牛血清中可能存在的激素所帶來的影響，在侵襲實驗前48 h換上無血清培養液，在第24 h加入相應試劑。消化細胞，PBS漂洗一遍后，用無血清培養液重懸細胞。用PBS稀釋適量單細胞懸液后進行計數。用無血清培養液按1∶8比例將Matrigel基質膠稀釋(提前將Matrigel基質膠置于4 ℃冰箱過夜融化)。將已預冷過的小室放入24孔板中，每個小室內加入100 μl稀釋過的Matrigel基質膠，盡可能避免氣泡產生。小室放入37 ℃培養箱內，靜置30 min，以凝固基質膠。膠凝固后吸棄小室上層殘余的少量液體，上室加入200 μl無血清培養液，下室加入500 μl無血清培養液后再次放入培養箱，水化30 min；吸棄Transwell小室上、下層內的無血清培養液。制備細胞懸液(5×105/ml)，并吸取200 μl的細胞懸液加入小室上層，加入相應試劑。吸取600 μl完全培養基加入小室下層，放入培養箱，孵育24 h；吸棄上室和下室內的液體，用95%的酒精固定細胞10 min；棄去酒精，用棉簽輕輕擦除上室的細胞和基質膠，用600 μl潔凈、無雜質1% 結晶紫對小室底面的細胞進行染色10 min，然后在流水中漂洗小室，將染料洗去后顯微鏡觀察照相，每個小室隨機選取5個視野進行計數和結果分析。

2.4.2 遷移實驗：操作同侵襲實驗流程，但不鋪Matrigel基質膠。

結 果

1 MTT篩選雌激素β受體拮抗劑PHTPP對細胞的作用濃度 為了明確PHTPP對A549細胞的有效作用濃度和作用時間，我們利用MTT實驗進行了驗證。發現當PHTPP作用于A549細胞24 h后，在10-5mol/L和10-6mol/L兩組濃度下，兩種細胞幾乎不存活(P<0.05)，考慮藥物濃度較大時，其毒性作用導致了細胞的死亡；而當其濃度稀釋至10-7mol/L后，對增殖沒有明顯的影響(P>0.05,圖1)。通過閱讀文獻[10-11]，發現PHTPP的濃度為E2或DPN的10倍時方能發揮其拮抗雌激素β受體的能力；再根據前期課題組的研究結果[9]，選擇后續實驗中PHTPP的濃度為10-7mol/L。

A:不同濃度的PHTPP作用于A549細胞24 h細胞增殖的變化；B:不同濃度的PHTPP作用于A549細胞48 h細胞增殖的變化；與濃度為0組比較，*P<0.05圖1 不同濃度的PHTPP 對A549細胞增殖的影響

2 PHTPP可拮抗DPN對A549細胞克隆形成能力的提高 根據已有的MTT實驗結果，并結合參考文獻，選擇的PHTPP的作用濃度為10-7mol/L，以此計算給藥劑量。在接種細胞14 d后，對各組細胞形成的克隆進行計數，結果提示：ERβ 激動劑DPN在10-8mol/L時可提高A549細胞的增殖能力，而ERβ 拮抗劑PHTPP在10-7mol/L時對A549細胞的增殖能力無顯著影響，但可拮抗ERβ 激動劑DPN所提高的細胞克隆形成能力。見圖2。

A:各組細胞平板克隆形成圖(結晶紫染色，×10)；B：各組細胞平板克隆形成能力的變化，與對照組相比，*P<0.05圖2 拮抗ERβ 對A549細胞克隆形成能力的影響

3 PHTPP可拮抗DPN對A549細胞遷移和侵襲能力的提高

3.1 應用PHTPP后對A549細胞細胞遷移能力的影響:應用Transwell小室遷移實驗來檢測ERβ 拮抗劑處理后肺癌細胞在體外的遷移能力，結果提示：ERβ 激動劑DPN在10-8mol/L時可提高A549細胞的遷移能力，而ERβ 拮抗劑PHTPP在10-7mol/L時對A549細胞的遷移能力無顯著影響，但可拮抗ERβ 激動劑DPN所提高的細胞遷移能力。見圖3。

A:各組細胞遷移圖(結晶紫染色,×200)；B:各組細胞遷移能力的變化，與對照組相比，*P<0.05圖3 拮抗ERβ 對A549細胞遷移能力的影響

3.2 應用PHTPP后對A549細胞侵襲能力的影響:應用Transwell小室侵襲實驗來檢測ERβ 拮抗劑處理后肺癌細胞在體外的侵襲能力，結果提示：ERβ 激動劑DPN在10-8mol/L時可提高A549細胞的侵襲能力，而ERβ 拮抗劑PHTPP在10-7mol/L時對A549細胞的侵襲能力無顯著影響，但可拮抗ERβ 激動劑DPN所提高的細胞侵襲能力。見圖4。

A:各組細胞侵襲圖(結晶紫染色，×200)；B.各組細胞侵襲能力的變化；與對照組相比，*P<0.05圖4 拮抗ERβ 對A549細胞侵襲能力的影響

討 論

腫瘤免疫學領域發展迅速，基于免疫的治療，如程序性死亡1(PD-1)和程序性死亡配體1(PD-L1)相關抗體，已經使NSCLC的治療發生了革命性的變化。盡管部分患者持續緩解并延長了生存期，但80%的晚期非小細胞肺癌患者對目前批準的基于單一檢查點抑制劑的免疫療法無效[12]，并且觀察到獲得性耐藥現象[13]。還有一個日益嚴重的公共衛生問題是，婦女和不吸煙者(其中大多數是女性)中非小細胞肺癌發病率和病死率正在上升。

激活雌激素相關途徑不僅直接促進肺腫瘤細胞的生長，還可能影響腫瘤微環境內的免疫細胞和間質細胞，從而通過調節免疫檢查點而發揮作用。此外，臨床前和臨床資料表明，雌激素信號途徑相關拮抗劑對NSCLC的治療是有益的[14]。

在前期實驗中，我們證明了E2通過激活ERβ，促進了肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。為了進一步全面地了解ERβ 在NSCLC中對細胞生物學功能的作用，我們利用MTT篩選了ERβ 特異性拮抗劑PTHPP對A549細胞的作用濃度。然后采用平板克隆形成、Transwell遷移和侵襲實驗等方法檢測了使用PTHPP拮抗ERβ 后對A549細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，結果顯示通過拮抗ERβ 可以有效的逆轉DPN促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲的作用。這一結果，與課題組前期使用雌激素受體共抑制劑ICI抑制雌激素促進肺癌骨轉移的細胞功能學實驗結果相吻合[15]。基于這樣的結果，ERβ 可能為NSCLC的防治，尤其是腫瘤免疫治療方面提供新思路和方法。