紅景天苷對MPTP-帕金森病小鼠模型自噬通路影響的實驗研究

王松海，許 鵬，康 超，陳 捷，楊晨光，謝燕華

陜西省中醫醫院腫瘤科(西安 710003)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是神經退行性疾病中僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的運動功能障礙性疾病，全球65歲以上人口發病率約2%～3%。PD的神經病理學特征主要是黑質神經元丟失導致黒質紋狀體(SNpc)多巴胺缺乏，殘存神經元細胞內以a-突觸核蛋白為主要成分的路易小體(LBs)大量聚集[1]。在我國北京，大于 65 歲的人群中，男性患病率為1.7%，女性為1.6%，基本與發達國家發病率相同[2]。目前對于帕金森病的發病機制研究雖然越來越多，但是治療仍以緩解癥狀支持治療為主。紅景天作為一個有價值的藥用植物，我國自古就有將紅景天當作補品或治療疾病的藥物來使用的記錄。紅景天苷(Salidroside，Sal)主要是從紅景天的根、塊莖中提取出來的，具有較強的抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等活性[3-5]。我們前期體外實驗研究表明Sal具有抑制神經元細胞凋亡的作用[6]，同時在體外模型中我們還發現經Sal預處理后自噬通路相關蛋白也有明顯激活。因此本研究將繼續通過1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)建立PD動物模型，探討Sal的神經保護作用是否與自噬通路激活相關。

材料和方法

1 實驗材料 Sal(Sal，HPLC 法檢測純度> 98%，CAS:82373-94-2),購自四川維克奇生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM培養基、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG的抗體(二抗)購自碧云天公司。TH抗體、MPTP(購于Sigma)、羅丹明123(CAS:62669-70-9)購自Sigma公司;兔抗大鼠PINK1、Parkin、LC-3、Beclin1抗體(一抗)購自abcam(ab216144、ab15494、ab48394、ab207612)公司，Beta-actin抗體(一抗)購自abcam(ab8227)公司，Alexa594 標記的驢抗雞抗體(二抗)購自北京中杉(ZB-20301)公司。

2 實驗方法

2.1 實驗動物:雄性C57BL/6小鼠，體重22～25 g，8周齡，由第四軍醫大學實驗動物管理中心供應，動物房間的溫度被控制在(23±1)℃，按時換料換水，每隔12 h開關1次燈光，周期固定，實驗前將各組小鼠進行適應性養殖7 d。

2.2 動物分組：根據實驗設計，共分為三組(每組8～12只)。對照組(腹腔注射0.9%氯化鈉，14 d)，MPTP處理組(MPTP 30 mg/kg 7 d+等量鹽溶液7 d)，Sal治療組(Sal 50 mg/kg，1 h后+MPTP 30 mg/kg 7 d，第8天至第14天，用Sal 50 mg/kg處理)，每組7～10小鼠。

2.3 Sal對PD小鼠行為學的影響:爬桿試驗方法：選取直徑8 mm，長約50 cm表面粗糙鐵桿，用雙層紗布包裹，防止打滑。小鼠在測試前兩天可進行適應性訓練。試驗開始后，每組小鼠在藥物處理結束1 d后進行測試。將小鼠頭朝上放于桿的頂部，記載小鼠頭完全變成向下的時間(Tturn)，和小鼠完全爬下來到地板上(TLA)的時間。

2.4 免疫組化法:將切片置于在PBS 0.01 mol/L溶液中漂洗3次，10 min/次。放入一抗(雞抗TH抗體1∶400，1% 胎牛血清蛋白，0.3% Triton X-100)中室溫孵育24 h。后再次將切片放入PBS 0.01% 溶液中漂洗3次，10 min/次。后將切片放入二抗(Alexa594 標記的驢抗雞 1∶500) 中室溫避光孵育 2 h。處理結束后，同前，繼續漂洗，貼片，封片，避光保存。最后在熒光顯微鏡下觀察TH陽性神經元細胞存活情況。

2.5 Western blotting檢測:根據實驗設計，每組處理的中腦黑質分別加入100 μl裂解緩沖液。將裂解液放在冰上孵育30 min，然后以12000 g在4 ℃離心機中離心分離，離心5 min，收集上清液，各組提取液中蛋白質濃度用BCA方法測定。用SDS-PAGE凝膠電泳。后進行 Western Blot 檢測，ECL發光液發光檢測，Bio-Rad凝膠圖像儀掃描分析結果。每組實驗重復3次。求取平均值，從而算出每組SNpc中LC-3β、Beclin 1、PINK1、Parkin含量。

結 果

1 Sal對PD小鼠行為學的影響 小鼠在MPTP預處理后出現了典型的 PD 癥狀。PD小鼠行為學檢測結果顯示:與對照組比較，模型組小鼠Tturn及TLA明顯延長(P<0.01);而給予 Sal(50 mg /kg) 治療后，與MPTP組比較，小鼠的Tturn轉頭時間和TLA爬桿時間顯著縮短(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05圖1 Sal對PD小鼠行為學的影響[A：Sal化學結構；B：小鼠頭完全變成向下的時間(Tturn)； C：小鼠完全爬下來到地板上的時間(TLA) ]

2 Sal對SNpc內 TH細胞水平的影響 通過免疫組化的方法對PD小鼠模型SNpc中TH陽性神經元細胞進行檢測。與正常組比較，PD模型組小鼠 TH陽性神經元數目下降明顯，而經過Sal提前干預治療后的TH陽性神經元數目明顯恢復。與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A：TH陽性細胞在對照組;B:MPTP組;C:Sal+MPTP組;D:TH陽性細胞在各組中的統計，與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05圖2 Sal對黑質內 TH陽性細胞水平的影響

3 Sal對PD小鼠黑質紋狀體內LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin相關蛋白表達的影響 與對照組相比，MPTP處理后黑質紋狀體內LC-3β、Beclin1表達增多，PINK1、Parkin表達減少(P<0.01)，而Sal預處理可以明顯改善這些變化，如Sal預處理后，黑質紋狀體內LC-3β、Beclin1蛋白表達水平明顯下降，而PINK1、Parkin蛋白表達水平明顯上升(P<0.05)。見圖3。

注：與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.05圖3 Sal和MPTP對于SNpc內LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin的影響(A：LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin蛋白Western-blot結果;B：LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin蛋白統計分析結果)

討 論

目前認為PD發病機制的學說主要有運動神經元異常凋亡學說、線粒體功能障礙學說、氧化應激學說等，盡管他們有著不同的流行病特點，但仍然有一些共同的生化病理特征，比如殘存神經元細胞內以a-突觸核蛋白的大量聚集[5-7]。我們以前的研究結果證明紅景天苷具有抑制細胞內氧化應激,進一步的研究還表明Sal可以激活細胞內異常蛋白聚集清除系統-泛素蛋白酶系統[8]，但是對于損傷或凋亡細胞內器官的自動降解途徑-自噬系統，是否在帕金森病的發病過程中起到作用，仍需我們進一步的研究。

目前人們研究表明細胞內蛋白質形成與降解的動態平衡對于細胞的存活非常關鍵，泛素蛋白酶系統(UPS)和自噬-溶酶體途徑(ALP)是修復或者清除異常蛋白的重要途徑[9-11]。有實驗研究結果表明，早期在帕金森病發病過程，氧化應激等因素導致線粒體膜受損，引起膜電位去極化，使得細胞膜上PINK1蛋白被激活，激活后的PINK1蛋白轉位到線粒體外膜，誘導下游Parkin在線粒體外膜聚集[12-13]。Parkin在線粒體外膜的聚集可以加強線粒體的分裂，從而有利于受損傷的線粒體被清除。同時Parkin移位到線粒體后E3泛素連接酶的活性增加，使得多種線粒體底物泛素化，從而使得受損的線粒體被清除掉。同時Parkin介導的線粒體泛素化后，泛素結合接頭蛋白P62既可與線粒體底物結合，又可與LC3、Beclin1結合介導泛素化線粒體進入自噬體，然后通過自噬體與溶酶體融合以清除受損線粒體[14-15]。

因此本研究采用MPTP-C57BL/6小鼠模擬PD體內模型，經Sal預處理后，其行為協調能力得到一定程度的改善，受損的TH 陽性神經元明顯減少。進一步我們發現SNpc內自噬相關蛋白LC-3β、Beclin1表達增多，PINK1、Parkin表達減少，經Sal預處理后上述損傷可明顯改善。綜上所述，Sal對于PD模型中DA能神經元的保護機制可能與激活線粒體相關自噬通路有關，與我們之前PD體外研究的結果一致。