沉默SOCS1基因表達(dá)對人口腔癌KB細(xì)胞增殖的機(jī)制研究*

張樹鷹，馮 瑤

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔惠民綜合門診(錦州 121000)；2.佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓一科(佳木斯154004)

口腔癌為臨床常見惡性腫瘤，我國口腔癌發(fā)病率約為全身惡性腫瘤的1.5%～5.6%，目前臨床依然缺乏行之有效治療手段，研究表明對于腫瘤患者癌灶惡化程度越大其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越高[1]。腫瘤惡化與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞異常凋亡或增殖密切相關(guān)，近期有研究表明惡性腫瘤屬于多基因、多途徑、多因素的過程，發(fā)病與多種基因異常表達(dá)有關(guān)，而進(jìn)一步探究影響口腔癌惡性行為的關(guān)鍵基因，或可為口腔癌早期診治提供參考[2]。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(Suppressor of cytokine signal transduction 1，SOCS1)在腫瘤惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用，SOCS1高表達(dá)不僅會阻礙癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移且會抑制癌細(xì)胞侵襲[3]，研究表明，沉默SOCS1表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并阻止惡性轉(zhuǎn)化[4]；小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)作為目前臨床常用基因沉默技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤相關(guān)功能研究中。但目前關(guān)于siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲影響的研究尚處于初步探索階段，為此本文展開臨床研究，結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)試劑和材料 ①人口腔癌KB細(xì)胞株，兔抗人SOCS1多克隆抗體(H93)以及兔抗人β-actin多克隆抗體，人口腔癌細(xì)胞株(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，10%胎牛血清(杭州四季清生物工程材料研究所)、RNA提取試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)(371型，美國FORMA)、細(xì)胞基質(zhì)膠(BD公司)、RT-PCR試劑盒、核酸內(nèi)切酶(NEB)、SOCSl抗體(Sigma)、13-actin抗體(武漢，博士德)、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(南京，碧云天)、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、預(yù)染蛋白Marker(美國，Thermo Fisher Scientific)、引物(上海生工公司)、流式細(xì)胞儀(美國，BD)，梯度PCR儀(美國，Applied Biosys.tems 9700)。②人口腔癌KB細(xì)胞入組標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)格齊全，質(zhì)量可靠，均凍存于本院生化藥理研究室內(nèi)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 KB細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞凍存管放置在37 ℃水浴鍋中以融化，細(xì)胞液溶解后離心5 min，吸棄上清液，凍存管內(nèi)加入洛斯維·帕克紀(jì)念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)-1640培養(yǎng)基中，懸液吸至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加3 ml完全培養(yǎng)箱中(5%CO2、95%飽和濕度，37 ℃)培養(yǎng)，次日對細(xì)胞貼壁狀態(tài)進(jìn)行觀察并更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長至覆蓋瓶底約85%時開始傳代，擦拭臺面(酒精)，將舊培養(yǎng)液吸棄，加 PBS 洗滌2遍細(xì)胞。0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化，細(xì)胞逐漸變圓、細(xì)胞間隙增大時，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，同時停止消化。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，常規(guī)離心。棄上清液，加新鮮 RPMI-1640完全培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)。選生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)期的細(xì)胞凍存。

2.2 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測：KB細(xì)胞溶解后，滴至小玻片處，并置于培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2、培養(yǎng)3 d)，采用PBS洗滌2次-甲醛固定-PBS清洗-甲醛雙氧水室溫浸潤-蒸餾水清洗-滴加封閉液以及一抗(對照組以PBS液代替)、PBS清洗后滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG、37 ℃孵育30 min、PBS清洗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片，鏡下觀察；結(jié)果判斷：高倍鏡下細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性。SOCS1基因mRNA序列設(shè)計(jì)：有效siRNA序列：sense 5’-GACUGAUUCCUAUUAAAUA-3’，anti sense 5’-UAUUUAAU AGG AAUC AGUC-3’，人類基因外顯子不存在同源性。陰性對照siRNA序列：sense 5’-ATTGTTTAGTTTTGTGTTAGGAGTTTT-3’，anti sense 5’-ACCAACAACTACCTACTCCCTAAAC-3’。

2.3 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞增殖設(shè)計(jì)：四唑鹽比色試驗(yàn)進(jìn)行檢測，采集空白對照組、陰性組、轉(zhuǎn)染組KB細(xì)胞，細(xì)胞密度1×104/孔，培養(yǎng)板上行細(xì)胞接種，每次設(shè)置5個復(fù)孔，細(xì)胞干預(yù)24、48、72、96 h，培養(yǎng)板上加入20 μl/孔四唑鹽，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 h。丟棄上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，檢測每孔(波長=490 nm)的吸光值，細(xì)胞增殖率=樣本組OD值與空白對照組OD值的比值。

2.4 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞凋亡的檢測：流式細(xì)胞儀檢測，KB細(xì)胞指數(shù)期增長時，胰蛋白酶進(jìn)行消化，細(xì)胞密度=4.0×105個/孔，在六個孔板中進(jìn)行接種并培養(yǎng)24 h，而后加吉西他濱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，上清培養(yǎng)基移至離心管中，PBS清洗1遍后，胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞懸浮液吸出，吸至離心管內(nèi)，離心5 min后將上清液丟棄，應(yīng)用PBS清洗后再次離心，將上清液丟棄，加入300 μl PBS進(jìn)行重懸，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后兩天內(nèi)收集各組的細(xì)胞，PBS清洗3次后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

2.5 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞侵襲的檢測：Materigel膠與預(yù)冷無血清MEM培養(yǎng)基，按1∶8比例稀釋，每孔50 μl均勻包被在Transwell小室底部膜內(nèi)表面，培養(yǎng)箱中放置使成膠，確保細(xì)胞沿低營養(yǎng)室往高營養(yǎng)室進(jìn)入，取對數(shù)生長期KB細(xì)胞，經(jīng)消化離心后，培養(yǎng)基中進(jìn)行重懸計(jì)數(shù)，每個內(nèi)室加200 μl細(xì)胞懸液，每孔加5.0×105個細(xì)胞。24孔板外室加700 μl含5%胎牛血清培養(yǎng)基，共培養(yǎng)24 h，將上清液及細(xì)胞等去除，PBS清洗1次，甲醛固定后應(yīng)用PBS清洗后進(jìn)行染色、水洗同時風(fēng)干、封片，鏡下觀察，相對侵襲指數(shù)=(轉(zhuǎn)染細(xì)胞穿膜數(shù)/未轉(zhuǎn)染細(xì)胞穿膜數(shù))×100%。

結(jié) 果

1 人口腔癌KB細(xì)胞中SOCS1表達(dá)情況 SOCS1基因在人口腔癌KB細(xì)胞中呈明顯陽性表達(dá)，鏡下觀察見細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色(圖1、2)。

圖1 人口腔癌KB細(xì)胞中SOCS1表達(dá)呈陽性，細(xì)胞膜及或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色(蘇木素染色,×200) 圖2 PBS對照組SOCS1表達(dá)情況，呈陰性，均為細(xì)胞免疫化學(xué)染色(蘇木素染色,×200)

2 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞增殖的影響 siRNA沉默SOCS1基因后24、48、72、96 h，轉(zhuǎn)染組人口腔癌KB細(xì)胞增殖率明顯低于陰性組(P<0.05)，見表1。

表1 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞增殖率的影響(%)

3 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染組人口腔癌KB細(xì)胞凋亡率高于空白對照組以及陰性組，但空白對照組人口腔癌KB細(xì)胞凋亡率高于陰性組(P<0.05)，見表2。

表2 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞凋亡的影響(%)

4 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞侵襲的影響 空白對照組、陰性組、轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)依次明顯減少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞侵襲的影響(個)

討 論

siRNA沉默是近年來日益興起的基因沉默技術(shù)，為臨床常用下調(diào)基因表達(dá)工具，研究證實(shí)siRNA沉默可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、生長及侵襲，有望為腫瘤的分子診斷及基因靶向治療提供理論依據(jù)[5]。目前通過抑制特定基因表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤增殖生長等惡性生物學(xué)行為的方法在分子生物學(xué)研究中日益普遍，而siRNA沉默技術(shù)有操作簡單、成本低、周期短及特異性和高效性等明顯優(yōu)勢，故而近年來關(guān)于siRNA沉默腫瘤特定基因的研究日漸報(bào)道[6]。SOCS1基因作為細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子蛋白家族中的重要成員，其參與多種類型腫瘤的生成及發(fā)展[7]，研究證實(shí)SOCS1沉默后，人頰癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)行為被明顯抑制[8]。

于鴻等[9]的研究證實(shí)，siRNA沉默技術(shù)可有效下調(diào)臍血樹突狀細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)，可為腫瘤患者靶向抗腫瘤治療提供新方向；閆俊等[10]學(xué)者文獻(xiàn)報(bào)告則指出SOCS1基因沉默后，人膀胱癌細(xì)胞增殖率及體外侵襲能力明顯降低，但化療敏感性明顯增強(qiáng)；因此推測siRNA沉默SOCS1基因?qū)Π┘?xì)胞的增殖、凋亡及侵襲等過程影響較大[11]，而本文擬通過觀察siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，以期為口腔癌患者基因靶向治療提供參考。本結(jié)果顯示，SOCS1基因在人口腔癌KB細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，且SOCS1基因沉默后24、48、72、96 h轉(zhuǎn)染組人口腔癌KB細(xì)胞增殖率明顯低于陰性組，初步表明siRNA沉默SOCS1基因可有效抑制人口腔癌KB細(xì)胞的增殖能力，同時明顯控制口腔癌細(xì)胞增殖，利于疾病進(jìn)展的有效防控[12]，與上述閆俊等學(xué)者的研究基本相符。本結(jié)果同時顯示，轉(zhuǎn)染組人口腔癌KB細(xì)胞凋亡率高于空白對照組和陰性組，空白對照組人口腔癌KB細(xì)胞凋亡率高于陰性組，而空白對照組、陰性組、轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)依次明顯減少，初步證實(shí)siRNA沉默SOCS1基因可明顯促進(jìn)人口腔癌KB細(xì)胞的凋亡，并有效抑制KB細(xì)胞的侵襲能力，siRNA沉默可有效下調(diào)SOCS1基因表達(dá)同時激活有關(guān)信號通路，繼而明顯抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，有效減弱口腔癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力[13-14]，與朱郁文等[15]學(xué)者研究指出的干擾人口腔癌細(xì)胞株KB中的SOCS1基因表達(dá)，可明顯抑制KB細(xì)胞增殖、侵襲能力的結(jié)果基本相符。但不同的是，本文初步證實(shí)了siRNA沉默SOCS1基因可有效促進(jìn)人口腔癌KB細(xì)胞的凋亡，分析具體機(jī)制為siRNA沉默SOCS1基因后人口腔癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為被有效的抑制，有望為口腔癌的靶向治療提供新思路。

綜上所述，siRNA沉默SOCS1基因?qū)θ丝谇话㎏B細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲能力的影響明顯，或可為口腔癌的基因靶向治療提供參考。但目前關(guān)于siRNA沉默SOCS1基因影響KB細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲作用的確切信號傳導(dǎo)通路尚不知，未來研究中可從這一方面完善。