羔羊STEC的耐藥性、毒力基因和血清型分析

張 凌，佟盼盼，張 毅，馬曉玉，張萌萌，劉璐瑤，姚 剛，陳童錦悅，蘇戰強

(新疆農業大學動物醫學學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)通常被認為是一種多種動物都攜帶的腸道共生菌，但是某些大腸桿菌會導致動物和人類發病和死亡[1]。其中，產志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)引發的人類疾病最為嚴重。新疆作為主要羊肉銷量地區之一，關注新疆羊源STEC的攜帶能力和致病潛力是必要的。【前人研究進展】全世界每年STEC導致3 890例溶血性尿毒癥(Hemolyticuremicsyndrome，HUS)，270例終末期腎病，230例死亡，用于治療的直接和間接費用超過10億美元[2]。我國曾在蘇皖地區發生過一次STEC爆發[3]，牛被認為是STEC最主要的宿主，而且相關的研究也較多[4]。研究表明，牛之外的許多動物也常常攜帶并不斷排出STEC，最常見的STEC排菌量較多的動物是綿羊、山羊[5]，當然，豬、貓、犬，及野生動物海鷗和鹿等都有攜帶STEC的報道[6, 7]。【本研究切入點】我國關于羊源STEC的攜帶情況鮮有報道，只有極少數地區曾經報道從羊糞便中分離到了STEC，而對于羊源STEC菌株毒力基因亞型及耐藥性的研究幾乎沒有。2010年到2014年，新疆人的羊肉消費量約占全國消費量的40%[8]。研究新疆羊源STEC的耐藥性和毒力情況，評價羊源STEC在羊產業鏈飼養階段的風險。【擬解決的關鍵問題】研究采集新疆阿克蘇地區某規模化養殖場的2月齡羔羊肛拭子，進行羊源STEC的分離鑒定，對羊源STEC的耐藥性和毒力基因做了研究，為羊源STEC的致病潛力提供一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集及處理

2018年10月，于新疆阿克蘇地區某規模化養殖場，用生理鹽水浸潤的無菌棉棒隨機采集2個月左右健康杜泊羔羊的肛拭子21份，放入3 mL的EC肉湯液體培養基中，低溫帶回實驗室。之后，在37℃培養箱中培養12 h，再進行STEC和E.coliO157：H7的分離鑒定。

1.1.2 主要試劑與儀器設備

EC肉湯、麥康凱培養基(MAC)，山梨醇麥康凱培養基(SMAC)均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；PCR 反應相關試劑(2×Taq PCR Green Mix、ddH2O)，購自新疆寶信生物工程有限公司。

空氣浴振蕩恒溫培養箱(型號 MOD-EL：ST-F160AC)；SW-CJ-2F 雙人雙面垂直潔凈工作臺(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；Eppendorf Mastercycler nexus GSX1 PCR 儀；DYY-7C 型電泳儀(北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統TRANSILLUMINATOR JVLABO；高溫高壓滅菌鍋(型號 HVE-50)。

1.1.3 引物設計合成

列出引物序列信息，引物均由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成。表1

表1 引物序列

1.2 方 法

1.2.1 STEC的分離鑒定

菌液PCR：用上述1.1.1的EC肉湯培養液做菌液雙重PCR(stx1與stx2)，體系為2×TaqPCR MasterMix 7μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，將ddH2O補至12.5 μL。引物參照表1。PCR運行程序：94℃預變性3 min，94℃變性 30 s，59℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30個循環，72℃延伸10 min。擴增后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統觀察并記錄結果。表1

菌落PCR：將菌液PCR檢測出有陽性條帶的培養液接種于MAC平板上，37℃培養12 h，挑選出5個粉紅色的單菌落，取其1/2做菌落雙重PCR，將有陽性條帶菌落的另外1/2純化保存。

1.2.2E.coliO157:H7的分離鑒定

使用上述1.1.1的EC肉湯培養液接種于SMAC平板上，37℃過夜培養，次日挑選出具有白色菌落樣品的平板，從每個平板中挑選出5個無色的單菌落，接種于MUG培養基中，過夜培養，時間控制在12 h。次日在陰暗無光處使用紫外分析儀，挑選出無熒光的菌液，取一波爾環菌液再次接種于SMAC瓊脂平板上，從中選取5個無色單菌落的一半做菌落雙重PCR進行初次驗證，引物(rfbE與fliC)參見表1。體系為2×TaqPCR MasterMix 7 μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，將ddH2O補至12.5μl。PCR運行參數：94℃預變性3min，94℃變性 30 s，61℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環，72℃延伸10 min。擴增后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統觀察并記錄結果。將出現陽性條帶的另一半菌落純化保存。表1

1.2.3E.coliO157：H7是否STEC檢測

將分離株E.coliO157：H7做菌液雙重PCR，檢測是否含有stx1和/或stx2基因，判斷是否屬于STEC。

1.2.4 耐藥性檢測

1.2.4.1 菌株來源

受試菌株：分離到的10株STEC，E.coliATCC25922保存于實驗室。

1.2.4.2 藥敏試驗

根據臨床用藥情況選定18種抗菌藥物采用紙片擴散法測定菌株的耐藥性。包括氨芐西林(Amp)，阿莫西林/克拉維酸(A/C)，頭孢噻肟(CTX)，頭孢他啶(CAZ)，頭孢吡肟(FEP)，哌拉西林-他唑巴坦(TZP)，氨曲南(AZM)，慶大霉素(CN)，氨芐西林-舒巴坦(SAM)，阿米卡星(AN)，左氧氟沙星(LEV)，環丙沙星(CIP)，四環素(TE)，磺胺甲基異惡唑(SXT)，氯霉素(CHL)，多粘菌素(PB)，鏈霉素(S)，哌拉西林(PIP)。用電子游標卡尺測量抑菌環直徑，根據“革蘭氏陰性桿菌藥敏試紙盒”使用說明書提供的參考值判定結果。

1.2.4.3 耐藥基因檢測

通過PCR的方法檢測TEM，CTX，SHV3種耐藥基因。引物參照表1，使用2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，將ddH2O補至25 μL。SHV和TEM基因的PCR運行參數：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸 45 s，30個循環，72℃延伸10 min。CTX基因PCR反應參數：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，50℃退火30 min，72℃延伸45 s，33個循環，72℃延伸10 min。擴增后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察并記錄結果。

1.2.5 毒力基因與血清型檢測

對10株分離菌進行隔夜培養，用煮沸法提取DNA。使用PCR方法檢測分離株DNA提取液中ehxA，hlyA，eae，stx1a，stx1c，stx1d，stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2f，stx2g毒力基因，9株STEC檢測了O121，O45，O145，O103，O111，O26，O157血清型情況。參照表2的引物參數進行PCR擴增。使用25 μL體系，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各使用0.5 μL，DNA模版1 μL。擴增后使用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察并記錄結果。

表2 引物序列

1.2.6 綿羊血平板溶血性檢測

使用具有溶血素ehxA與hlyA的菌，在5%的綿羊鮮血瓊脂平板上接種劃線，37℃過夜培養，觀察溶血環結果。

2 結果與分析

2.1 STEC的分離鑒定

研究表明，通過對該養殖場的21份羔羊肛拭子的檢測，其中9份樣品中檢測出了STEC(stx1)，檢測率為42.86%。通過山梨醇發酵與MUG試驗結合雙重PCR的方式，分離到1株E.coliO157：H7，經檢測此株菌也屬于STEC(stx1)。圖1，圖2

注：M.DL2000 marker；“-”.陰性對照；“+”.陽性對照(O157：H7標準菌株CICC 21530)；1～9.STEC 菌株PCR擴增圖譜；10.E.coli O157：H7株驗證為STEC

注：M.DL2000；“-”.陰性對照；“+”.陽性對照(O157：H7標準菌株CICC 21530)；10.E.coli O157:H7 PCR擴增圖譜

2.2 耐藥情況

研究表明，有2株STEC對頭孢吡肟具有耐藥性，耐藥率為20%。1株STEC對頭孢噻肟表現中度敏感，2株STEC對頭孢吡肟表現中度敏感，4株STEC對多粘菌素表現中度敏感。使用β-內酰胺類耐藥基因檢測10株菌的攜帶情況，沒有發現有相關耐藥基因。圖3

注：S.敏感；I.中介；R.耐藥

2.3 毒力基因及其亞型的攜帶情況

研究表明，除1株E.coliO157：H7以外，其他的9株STEC均不屬于O121，O45，O145，O26，O103，O111和O157。10株菌均有stx1基因。其中1株非O157 STEC與O157：H7 STEC菌株攜帶stx1，ehxA，hlyA3種毒力基因，并且毒力基因亞型均為stx1c。攜帶了stx1型的菌株60%含有stx1a，70%含有stx1c，40%攜帶stx1a+stx1c，并沒有攜帶stx1d的菌株。毒力基因分布情況見圖6，PCR擴增圖譜見圖4和圖5。使用兩株具有ehxA與hlyA的菌液在5%綿羊血平板上并未呈現出溶血環。圖4～6

注：M.DL2000；“-”.陰性對照；A：1～10.hlyA基因PCR擴增圖譜，B：1～10.ehxA基因PCR擴增圖譜

注：M.DL2000；“-”.陰性對照；A：1～10.stx1a 基因PCR擴增圖譜；B：1～10.stx1c 基因PCR擴增圖譜

圖6 毒力基因分布情況

3 討 論

產志賀毒素大腸桿菌是一類危害嚴重的人畜共患病原菌[16]。近年來，由非 O157 STEC引起的食物中毒事件持續增長，因此檢測致病性大腸桿菌STEC非常重要[5]。羊作為新疆畜牧業發展的優勢群體，羊肉在新疆的肉源食品中占有重要地位。關注羊源STEC的流行狀況至關重要。國外有許多關于羊源STEC的報道。在西班牙，羊源STEC O157:H7菌株與非O157 STEC菌株的分離率為1.0%與35.0%，也不乏有一些高分離率達到8.7%與50.8%[17]。在德國，從抽樣動物中分離出28.9%的STEC菌株，其中最常見的是綿羊和山羊[2]。巴西南部羊群中有50%被分離出STEC[18]。國內胡彬等于2017年與2018年分別在山東某地區報道過兩次羊的糞便中檢測到STEC，分離率為0.8%與0.0%[19, 20]。江蘇某地健康羊糞便分離率為19.4%[21]。而新疆有關羊源STEC的報道并不清楚。研究檢測了新疆阿克蘇地區某羊養殖場中STEC的攜帶情況，結果顯示該地區羊源STEC分離率達到(9/21)42.86%，遠遠高于我國已報道地區的分離率。

志賀毒素是STEC主要的致病物質，對細胞具有凋亡作用。志賀毒素分為兩類，即志賀毒素1(stx1)和志賀毒素2(stx2)，分別由stx1和stx2基因編碼[22]。志賀毒素還進一步分為不同的亞型，包括stx1a，stx1c，stx1d，stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2f，stx2g。不同的志賀毒素型，對人的致病性也有所差異。單獨攜帶stx1的菌株主要引起人的腹瀉，罕見引起HUS，而Stx2最易引起HUS[23]。stx2a亞型與人類溶血性腸炎(HC)等疾病密切相關。STEC的毒力表達還與內膜蛋白eae，腸溶血素ehxA和hlyA基因相關，許多作者強調攜帶eae基因的STEC菌株能引起嚴重人類疾病，特別是與HUS相關的一些疾病。這種重要的毒力基因在綿羊中只存在很小的比例，但是，內膜的產生與發病機制并沒有直接性關系。缺乏eae基因的菌株仍然在美國和澳大利亞產生過3例與HUS有關的病例[24]。ehxA與hlyA基因一般出現在腸出血性大腸桿菌(EHEC)中，EHEC可產生較大毒力，引起人類的血性腹瀉[25]。此次研究的10株菌中均檢測到了stx1，與山東地區報道的羊源非O157 STEC均為stx2不吻合[20]。毒力基因亞型的組合有40%為stx1a+stx1c組合，這與伊朗地區小牛和山羊及美國的櫻桃西紅柿攜帶的亞型組合有相同之處[26, 27]，毒力基因亞型與相關國外羊源毒力基因亞型報道沒有較大差異，都以stx1c為主[28, 29]。此次研究中的菌株未攜帶eae基因，但是有攜帶ehxA與hlyA基因的菌株。羊源STEC對人的致病風險需要進一步探究。

STEC在不同的地理環境中存在的主要血清型是有所差異的。在巴西地區某羊群中以血清型O76與O65為主，并未發現血清型O157[18]。在澳大利亞，非O157 STEC菌株最常見的血清型是O111與O26，在歐盟，O157，O26，O111，O103和O145是最主要的血清型[2]。在伊朗，主要致病性血清型為O157和非O157 STEC中的O103和O128[30]。目前歐美等國主要檢測以O121為代表的血清型“Top Six”[5]。我國對STEC的血清型檢測以“Top Six”與O157為主。此次研究的10株菌中，除一株E.coliO157：H7，另外9株菌血清型不屬于“Top Six”和O157。羊源STEC中還具有許多血清型與人類的一些疾病密切相關，在已知的 101 種血清型中，23 種是從患有 HUS 的病人中分離到的[21]。所以新疆地區羊源的優勢血清型需要進一步的研究。

養殖業對抗生素的不規范使用，會給動物腸道內的菌株帶來一定的耐藥選擇性壓力[20]。國外的相關報道顯示，綿羊中STEC對鏈霉素、阿莫西林-克拉維酸和納利地克酸的耐藥率較高。Ghanbarpour等[31]發現綿羊中對青霉素的耐藥率較高。在我國，山東省某地區關于羊源STEC耐藥性研究結果表明，對磺胺異唑，復方磺胺異唑和萘啶酸，四環素和氯霉素等存在多重耐藥現象[19, 20]。研究對10株STEC檢測了18種常用抗生素的藥敏反應，有2株菌對頭孢吡肟耐藥，其耐藥率為20%，沒有發現其他耐藥性菌株。針對藥敏實驗的結果，對10株菌還做了β-內酰胺類耐藥基因檢測，尚未發現有耐藥基因的存在。這說明新疆羊源STEC對目前的抗菌素普遍敏感，反映出新疆羊群良好的養殖環境和較少的抗生素使用。

4 結 論

新疆阿克蘇地區某羊養殖場STEC的攜帶率(42.86%)較高，攜帶血清型“TOP 7”中O157 STEC分離株；10號O157 STEC與2號非O157 STEC出現在同一樣品中；菌株中攜帶常見毒力基因ehxA(20%)和hlyA(20%)，毒力基因亞型以stx1c(70%)為主，毒力基因亞型以stx1a+stx1c(40%)為主；菌株對藥物敏感性高，僅有20%的菌株對頭孢吡肟耐藥，且未發現耐藥基因的存在。結合此結果，羊源STEC具有較弱的潛在致病力，但是O157：H7與非O157 STEC出現在同一病原體上。