超高效液相色譜串聯質譜法同時測定面粉中曲酸和噻二唑

林芳

摘 要：建立超高效液相色譜-串聯四級桿質譜法（UPLC-MS/MS）同時測定面粉中曲酸和噻二唑的方法。色譜柱為ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），流動相為0.1%甲酸5 mmol·L-1甲酸銨水溶液∶乙腈，梯度洗脫，流速為0.45 mL·min-1。采用多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM），曲酸為ESI正電離源，定量離子對140.3/69;噻二唑為ESI負電離源，定量離子對130.8/57.9。樣品經純水超聲提取30 min，過膜后直接測定，外標法定量。結果表明，曲酸在1.00～50.00 ?g·L-1，噻二唑在10.00～500.00 ?g·L-1范圍內線性關系良好，相關系數≥0.995。面粉樣品中3個濃度加標水平即曲酸含量0.10、0.20和0.40 mg·kg-1，回收率為100.00%～105.00%，相對標準偏差為2.50%～10.72%;噻二唑含量1.00、2.00和4.00 mg·kg-1，回收率為86.00%～89.00%，相對標準偏差為3.65%～9.97%。該方法操作簡便、回收率高，可用于大批量面粉中曲酸和噻二唑的同時測定。

關鍵詞：面粉;曲酸;噻二唑;超高效液相色譜串聯質譜法

Abstract：A new method was developed for the determination of Kojic acid （KA） and 2-mercapto-5-methyl-1，3，4-thiadiazde （MMTD） in flour by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry/mass spectrometry. The chromatography column was ACQUITY UPLC? BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 ?m）， mobile phases were 0.1%formic with 5 mmol·L-1 ammonium formate in water solution and acetonitrile， with gradient elution， the flow rate was 0.45 mL·min-1. Using multiple reaction monitoring （MRM） mode， the ESI mass spectrometry was positive ion source for KA， 143.1/69 and negative ion source for MMTD， 130.8/57.9. The sample was extracted by water solution， the quantitation was carried out with the external standard method. The linear range of the method was 1.00～50.00 ?g·L-1 for KA and 10.00～500.00 ?g·L-1

for MMTD， with a correlation coefficient not less than 0.995. The recoveries in flour matrix at the three spiked levels of 0.10， 0.20， 0.40 mg·kg-1 for KA and 1.00， 2.00，4.00 mg·kg-1 for MMTD， were in the range of 100.00%～105.00% for KA and 86.00%～89.00% for MMTD， and the relative standard deviations were in the range of 2.50%～10.72% for KA and 3.65%～9.97% for MMTD. The method is simple， high recoveries and is suitable for the simultaneous confirmation and quantificaition of KA and MMTD residue in flour which applies in batch detection.

Key words：Flour; Kojic acid; 2-mercapto-5-methyl-1，3，4-thiadiazde （MMTD）; UPLC-MS/MS

中圖分類號：TS207.3

曲酸（Kojic acid，KA），化學名為5-羥基-2-羥甲基-1，4-吡喃酮，易溶于水、乙醇和丙酮，1907年由齋藤從蒸米發酵物中發現[1]。曲酸具有多種生物活性，如抑制酪氨酸酶活性[2-3]，廣泛在化妝品和藥物制劑中使用[4]，減少黑素的形成。聶西度等[5]表示曲酸分子中的羥基可以使人體內積累游離基有致癌性。陳永紅等[6]以小鼠為研究對象，發現體外試驗在一定時間內高質量濃度曲酸可以導致DNA損傷。因此曲酸的安全性已成為人們關注和爭論的焦點。噻二唑（2-Mercapto-5-methyl-1，3，4-thiadiazde，MMTD），學名2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑，溶于熱水、甲醇、乙醇，是生產頭孢菌素類等醫藥的重要中間體，具有抗菌性。有研究發現，MMTD對斑馬魚的胚胎具有一定的毒性[7]。

2017年第132號[8]指出嚴禁生產企業在小麥粉中添加噻二唑、曲酸等非食品原料。目前國內外檢測方法集中在對曲酸的檢測分析，如有電化學分析法[9]、近紅外光譜法[10]、膠束電動毛細管色譜法[11]、高效液相色譜法[12]、液質聯用測試[13]。關于食品中曲酸和噻二唑同時檢測的報道較少，本文建立了UPLC-MS/MS法同時測定面粉中曲酸和噻二唑，為安全監管提供可行性的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲酸標準品（CAS No. 501-30-4，純度99.9%），Be

Pure公司;噻二唑（CAS No. 29490-19-5，純度100%），

BePure公司;甲酸（HPLC級，純度99.0%），美國DiKMA公司;乙腈（HPLC級，純度99.9%），美國DiKMA公司;甲酸銨（AR級），上海凌峰化學試劑有限公司;實驗用水均為一級水，符合GB/T 6682-2008要求。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC H-Class系列超高效液相-串聯Waters XEVO TQ-S micro型三重四級桿串聯質譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）及MassLynx V4.2 SCN 1001數據處理軟件），美國Waters公司;SF-TGL-16M型高速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司;XW-80A

型漩渦器，上海青浦滬西儀器廠;950DAE超聲儀，美國ETL TESTING公司;JA2003A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司;Milli-Q型超純水儀，密里博中國有限公司;0.45 ?m針式聚四氟乙烯濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司;100 ?L、1000 ?L移液槍，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC? BEH C18

（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），柱溫：45 °C，流速：

0.45 mL·min-1，進樣量為10 ?L，梯度洗脫，程序見表1。

1.3.2 質譜條件

采用多反應監測（MRM）;脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流速：1 000 L/H，毛細管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150 ℃，孔電壓15 V，駐留時間：0.075 s。采用正負模式切換的電噴霧離子源，曲酸電噴霧為正離子模式（ESI+），定量離子對143.1/69，碰撞能為15 v;定性離子對143.1/97.1，碰撞能15 v。噻二唑電噴霧為負離子模式（ESI-），定量離子對130.8/57.9，碰撞能15 v;定性離子對130.8/89.8，碰撞能5 v。

1.3.3 前處理方法

稱取混勻后的樣品1.00 g，加入40 mL純水，超聲提取30 min，離心后，取上清液過0.45 ?m濾膜，注入液相色譜串聯質譜儀測試。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

一般正離子模式適合于堿性樣品，負離子模式適合于酸性樣品。分別配制濃度為1.00 mg·L-1的曲酸和噻二唑單標標準溶液在不接色譜柱的條件下，使用電噴霧正離子模式（ESI+）進行曲酸母離子全掃描和電噴霧負離子模式（ESI-）進行噻二唑母離子全掃描。確定曲酸的母離子m/z 143.1和噻二唑的母離子m/z 130.8，利用手動優化模式對它們的子離子、孔電壓和碰撞能等參數進行優化，確認優化后的參數，根據優化后的最佳質譜條件建立曲酸的ESI（+）和噻二唑ESI（-）的多反應監測方法。

2.2 色譜柱的選擇

比較了Waters CORTECS? HILIC和Waters ACQUITY

UPLC? BEH C18兩種柱子。經實驗表明，200 ng的噻二唑在采用Waters CORTECS? HILIC柱上響應值高，但對曲酸的保留性能很差，而選擇Waters ACQUITY UPLC? BEH C18 作為分離柱，曲酸（圖1中1）和噻二唑（圖1中2）可以同時在色譜柱上有保留（圖1所示），能完全分開。

2.3 前處理提取液的選擇

根據曲酸和噻二唑都易溶于水的性質，考察了水、乙腈和50%乙腈水作為提取溶劑的提取效率。在陰性樣品進行標準溶液的添加，曲酸的添加量為0.1 mg·kg-1，噻二唑的添加量為1.0 mg·kg-1。實驗表明，含有乙腈的提取溶劑，對噻二唑的提取效率沒有影響，但在曲酸出鋒位置有個干擾峰，沒法分開，影響了曲酸的定性及定量，而水作為提取溶劑時，干擾峰（圖2中的1）可以與目標峰（圖2中的2）分開，如圖2所示，同時也滿足了提取的回收率要求，所以選擇水作為提取溶劑。

2.4 線性范圍和方法的檢出限、定量限

將配有曲酸1.00、2.50、5.00、10.00、25.00 ?g·L-1和50.00 ?g·L-1，噻二唑10.00、25.00、50.00、100.00、250.00 ?g·L-1和500.00 ?g·L-1的混合系列基質標準曲線溶液注入超高效液相色譜串聯質譜儀測試，分別以峰面積對曲酸和噻二唑的質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。

參考GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》中空白偏差法評估方法檢出限和定量限。具體操作如下：分別在10個空白樣品中加入曲酸和噻二唑混合標準溶液，制成含有曲酸2.50 ?g·L-1和噻二唑25.00 ?g·L-1的樣品溶液，分別注入超高效液相色譜串聯質譜儀測試，得曲酸和噻二唑含量，分別計算曲酸和噻二唑含量的3倍標準偏差即為方法檢出限，10倍標準偏差即為方法定量限。結果表明，曲酸在1.00～50.00 ?g·L-1，噻二唑在10.00～500.00 ?g·L-1時，標準曲線的相關系數r大于0.995，方法的檢出限和定量限如表2所示。

2.5 準確度和精密度

對陰性面粉樣品進行曲酸和噻二唑標準溶液的加標回收實驗，曲酸的加標水平分別為0.10、0.20和0.40 mg·kg-1，噻二唑分別為1.00、2.00和

4.00 mg·kg-1，采用1.3.3的前處理方法對樣品進行處理，每個添加水平重復測定6次，計算曲酸和噻二唑在面粉樣品中的加標回收率及相對標準偏差。由表3可知，曲酸的回收率為100.00%～105.00%，相對標準偏差RSD為2.50%～10.72%，噻二唑的回收率為86.00%～89.00%，相對標準偏差RSD為3.65%～9.97%，方法的加標回收和精密度滿足質量分析的要求