液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定牛乳中慶大霉素

程艷宇　張金環(huán)　劉正　閆磊

摘 要：建立了一種不使用離子對(duì)試劑測(cè)定牛奶樣品中慶大霉素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢驗(yàn)方法。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液提取，然后在MCX固相萃取柱凈化，使用HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定性、定量分析，凈化液在高效液相色譜柱上以0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫分離，質(zhì)譜采集模式為電噴霧正離子監(jiān)測(cè)模式。結(jié)果表明，慶大霉素各組分C1、C2+C2a、C1a在10～1 000、20～2 000、10～1 000 ng·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性良好，相關(guān)系數(shù)均>0.99;方法的檢出限（LOD）分別為2.0、4.0、2.0 μg·kg-1，平均加標(biāo)回收率達(dá)到63.2%～90.3%。該方法取消了傳統(tǒng)方法的離子對(duì)試劑的使用，操作簡(jiǎn)便，滿足對(duì)慶大霉素的定性和定量的要求，避免了離子對(duì)試劑對(duì)質(zhì)譜的潛在影響。

關(guān)鍵詞：氨基糖苷;慶大霉素;固相萃取;液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法;離子對(duì)試劑

Abstract：A method was established for the determination of gentamicin in milk samples by HPLC-MS/MS without using ion pair reagents. The sample was extracted by trichloroacetic acid solution ，followed by MCX solid-phase extraction（SPE） as the cleanup procedure. High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry / Mass Spectrometry （HPLC-MS/MS） was used for identification and quantification of antibiotics. The separation was carried out on a CAPCELL PAK ST column with a gradient elution using 0.1% formic acid and acetonitrile. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using multiple reaction ion monitoring （MRM） mode.The results showed that in the range of 10～1000， 20～2000 and 10～1 000 ng·ml-1， the peak area and concentration of gentamicin components C1，

C2 + C2a and C1a have good linearity， and the correlation coefficient is >0.99; The LOD is 2.0， 4.0 and 2.0 μg·kg-1 and the average recovery is 63.2%～90.3%. The method canceled the use of traditional ion pair reagents，which could protect the mass spectrometer avoiding contaminating. It is simple to operate and meets the qualitative and quantitative requirements of gentamicin.

Key words：Aminoglycosides; Gentamicin; Solid phase extraction; HPLC-MS/MS; Ion pairing agent

中圖分類號(hào)：R917

慶大霉素屬氨基糖苷類抗生素，臨床上常用其混合物的硫酸鹽，主要有C1、C2、C1a和C2a共4種主要組分[1]，在畜禽養(yǎng)殖中作為獸藥應(yīng)用廣泛，被用于治療細(xì)菌感染。GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》對(duì)慶大霉素最高殘留限量作了規(guī)定，在牛/豬肌肉或脂肪中為100 μg·kg-1，肝臟中為2 000 μg·kg-1，腎臟中為5 000 μg·kg-1，牛奶中為200 μg·kg-1，雞/火雞可食組織中為100 μg·kg-1。目前慶大霉素的檢測(cè)方法有杯碟法[2]、液相色譜法[3]、酶聯(lián)免疫法[4]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[5]等。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是分離效率高、分析速度快、靈敏度高，在很多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[6]。慶大霉素結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有氨基和羥基，具有強(qiáng)極性，在提取和分離過(guò)程中常使用離子對(duì)試劑，如三氟乙酸[5]、七氟丁酸[7]等。但有報(bào)道稱七氟丁酸會(huì)抑制質(zhì)譜信號(hào)，尤其對(duì)質(zhì)譜負(fù)離子掃描有影響，對(duì)質(zhì)譜具有潛在的污染性[8]，降低負(fù)離子掃描的靈敏度，極大地限制了慶大霉素的檢測(cè)實(shí)施范圍。在探索離子對(duì)試劑替代的過(guò)程中，研究人員使用了高濃度的緩沖鹽如甲酸銨作為流動(dòng)相[9]，但緩沖鹽使用不當(dāng)易造成色譜柱中緩沖鹽析出，影響柱效。本文重點(diǎn)探索不使用離子對(duì)試劑和高濃度緩沖鹽，建立一種液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)牛乳中慶大霉素C1、C2+C2a、C1a的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀：島津LC30A-MS/MS8050;冷凍離心機(jī)：湘儀TGL-20M;Milli-Q超純水儀：MILLIPORE;N-EVAPTM111氮吹儀，美國(guó)Orgamonation公司;慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度90.8%（其中C1組分25.7%，C1a組分24.4%，C2+C2a組分50.0%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer;CAPCELL PAK ST色譜柱，2.0 mm×150 mm，三耀化工;MCX固相萃取柱，150 mg/6 mL，Waters公司;三氯乙酸、氨水均為分析純;乙腈（Merk）、甲醇（Merk）和甲酸（CNW）均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品11.0 mg（精確到0.1 mg），用水溶解并定容到100 mL，即為100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存，備用。吸取上述儲(chǔ)備液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用水稀釋并定容到10 mL，配制成10 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。精密量取標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用空白樣品基質(zhì)配制成不同濃度系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

（3）5%三氯乙酸的配制。稱取三氯乙酸50 g，用水溶解并定容至1 L。

（4）15%氨水乙腈的配制。量取150 mL氨水，用乙腈稀釋并定容至1 L。

（5）樣品前處理。準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入5%三氯乙酸溶液10 mL，均質(zhì)2 min，在平板振蕩器上振蕩10 min，在高速冷凍離心機(jī)上離心5 min（10 000 r·min-1，4 ℃），離心上清液過(guò)濾至另一50 mL離心管。在殘?jiān)性偌尤?0 mL 5%三氯乙酸溶液，重復(fù)提取1次，合并上清液，準(zhǔn)備過(guò)柱凈化。取MCX固相萃取柱（依次用5 mL甲醇、5 mL水活化），將上述提取液加載在固相萃取柱上，控制流速約1 mL·min-1，然后用5 mL水，5 mL2%甲酸水，5 mL甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，抽干。最后用10 mL氨水∶乙腈（3∶17）洗脫至塑料離心管中，40 ℃水浴條件下用氮?dú)鈸]發(fā)除去部分溶劑，用定容液定容至1.00 mL并渦旋混勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 液相色譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK ST色譜柱（2.0 mm×

150 mm），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為2 μL;流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，液相色譜梯度洗脫程序見表1。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源;掃描方式為正離子掃描;檢測(cè)方式為MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè);霧化氣流量為3 L·min-1;加熱氣流量為10 L·min-1;干燥氣流量為10 L·min-1;接口溫度為300 ℃，脫溶劑管溫度為250 ℃，加熱塊溫度為400 ℃，離子噴霧電壓為4.1 kV。優(yōu)化后的離子對(duì)及質(zhì)譜電壓參數(shù)等見表2，其中慶大霉素組分C2和C2a分子量相同，互為差向異構(gòu)體[1]，色譜柱無(wú)法將其分開，故463.90>322.10反映C2和C2a兩組分含量之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

慶大霉素結(jié)構(gòu)中含有氨基和其他堿性基團(tuán)，同時(shí)含有多種親水基團(tuán)，極性強(qiáng)，在C18色譜柱上保留弱。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)慶大霉素使用C18反相色譜柱，為加強(qiáng)對(duì)慶大霉素的保留，使用七氟丁酸作為離子對(duì)試劑，為避免離子對(duì)試劑對(duì)質(zhì)譜的潛在影響，本實(shí)驗(yàn)選用了2支親水作用色譜柱ACQUITY UPLC BEH Hilic及CAPCELL PAK ST色譜柱，兩個(gè)色譜柱均適用于分離強(qiáng)極性化合物[10]，分離模式為親水作用色譜（Hilic）模式，按照Alpert[11]的Hilic模式理論，采用水和水溶性有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，樣品在色譜柱上的流出順序與傳統(tǒng)HPLC類似，極性越強(qiáng)保留越強(qiáng)，出峰越晚。使用流動(dòng)相為0.1%甲酸、乙腈，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例及流速，使慶大霉素在兩支色譜柱上達(dá)到最好的分離效果。CAPCELL PAK ST色譜柱和BEH Hilic色譜柱分離慶大霉素的色譜圖如圖1、圖2所示，由圖可見，在0.4 mL·min-1流速條件下，慶大霉素在ST、BEH Hilic色譜柱上的保留時(shí)間分別為3.8 min、0.5 min，在ST色譜柱上的保留能力較BEH Hilic色譜柱強(qiáng)，且峰形較好，而在BEH Hilic色譜柱上響應(yīng)信號(hào)較低，因此選擇CAPCELL PAK ST色譜柱。

2.2 液相條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相優(yōu)化

在液相色譜中，流動(dòng)相的pH對(duì)化合物的分離有很大影響，本實(shí)驗(yàn)比較了0.1%甲酸與1%甲酸流動(dòng)相對(duì)慶大霉素在色譜柱上的保留能力，當(dāng)甲酸提高到1%時(shí)，慶大霉素的保留能力減弱，出峰時(shí)間偏早

（1.6 min），響應(yīng)面積降低，不利于慶大霉素的分離，因此選擇0.1%甲酸、乙腈作為流動(dòng)相，此時(shí)慶大霉素出峰時(shí)間為3.8 min。

2.2.2 定容液選擇

在流動(dòng)相確定的前提下，研究定容液對(duì)慶大霉素在色譜柱上分離的影響，選擇了5種定容液，分別為0.1%甲酸+乙腈（2+3）、1%甲酸+乙腈（2+3）、1%甲酸+甲醇（2+3）、2%甲酸+甲醇（2+3）、5%甲酸+甲醇（2+3），將慶大霉素分別溶解在這5種定容液中，溶液濃度為1 μg·mL-1，進(jìn)行儀器測(cè)定，比較慶大霉素的峰面積，結(jié)果如圖3所示，可以看出，5%甲酸+甲醇（2+3）定容液對(duì)應(yīng)的峰面積最高，因此選擇5%甲酸+甲醇（2+3）作為慶大霉素檢測(cè)的定容液。

2.2.3 進(jìn)樣容器選擇

對(duì)氨基糖苷類藥物的進(jìn)樣瓶容器，徐飛[12]的研究中使用塑料瓶，分析可能因?yàn)榘被擒疹愃幬锟膳c玻璃制品發(fā)生特異性吸附。試驗(yàn)對(duì)比了塑料進(jìn)樣瓶和玻璃進(jìn)樣瓶對(duì)慶大霉素響應(yīng)的影響，采用1 μg·mL-1慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用塑料進(jìn)樣瓶和玻璃進(jìn)樣瓶盛放，然后將進(jìn)樣瓶中的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別轉(zhuǎn)移到新的塑料進(jìn)樣瓶和玻璃進(jìn)樣瓶中，如此依次轉(zhuǎn)移至第4個(gè)進(jìn)樣瓶，在液質(zhì)聯(lián)用儀上測(cè)定，比較同一種進(jìn)樣瓶的第1個(gè)瓶和第4個(gè)瓶的響應(yīng)面積，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，塑料進(jìn)樣瓶對(duì)慶大霉素C1、C2+C2a、C1a的響應(yīng)峰面積影響不大，但是玻璃進(jìn)樣瓶對(duì)慶大霉素的影響卻比較大，轉(zhuǎn)移到第4瓶，響應(yīng)峰面積分別降低56.6%、53.9%、63.8%，因此選擇塑料進(jìn)樣瓶作為慶大霉素進(jìn)樣容器（圖4）。

2.3 凈化方法優(yōu)化