性別差異對大鼠佐劑性關節炎模型的影響

劉 琪，張巧琳，陳曉蕓，嚴尚學，吳華勛，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所, 抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽協同創新中心，安徽 合肥 230032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)主要損傷關節及滑膜組織，炎癥細胞的增多、滑膜增生以及血管翳的產生[1]，使關節畸形失去功能[2]。病程遷延難愈[3]，RA發病機制較為復雜，尚無理想的安全高效的治療方法，對其深入研究具有重要意義。在研究RA病理機制時常用大鼠佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)模型，其優點在于建模方法簡單，發病較為迅速。此外大鼠AA在關節腫脹及淋巴細胞浸潤等方面的表現與RA患者相似[4]，為研究RA提供了合適的動物模型。對RA進行研究時，研究者傾向于研究與此相關的疾病機制與治療方法等方面，較少涉及影響成模的因素問題。

某些與自身免疫有關的疾病發生率女性通常較男性高[5]，RA的發病率也是如此，這暗示了性別因素可能影響了RA的發病過程。這可能與女性對免疫具有較高的反應或與性別激素相關[6]。為探討性別因素在AA大鼠臨床表現和病理表現中的差異，選用雄性和雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，在足跖皮內注射完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)，含卡介苗10 g·L-1誘導大鼠AA模型，成模后對雄性和雌性大鼠的AA成模情況(全身表現及病理評分)進行分析。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑SD大鼠購自安徽省實驗動物中心，生產許可證號碼：SCXK(皖)2011-002。選取32只SPF級、體質量為180 g左右的雌雄SD大鼠，于SPF級實驗室飼養(安徽省實驗動物中心)。動物實驗計劃由安徽醫科大學臨床藥理研究所動物倫理委員會同意實施。試劑：CFA購自Chondrex inc公司。

1.2 AA模型的建立取含卡介苗10 g·L-1的CFA 100 μL，在大鼠的右后足足跖皮內注射建立模型。正常組選擇注射100 μL的生理鹽水。

1.3 動物分組綜合全身指標的評分，d 15,隨機將成模大鼠分為2組(每組8只)，即雄性和雌性大鼠模型組；設立2組正常組(每組8只)即雄性和雌性大鼠正常組。共計4組。

1.4 體質量和全身評分測定造模前(d 0)及造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)稱量體質量。觀察全身表現，進行全身評分[7]。

1.5 大鼠足爪腫脹度測定非致炎側(左后足)足爪容積在造模前(d 0)與造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)測定，求出繼發側(左后足)的足爪腫脹度[8]。

1.6 大鼠關節腫脹數和炎癥指數評分觀察造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)大鼠發生的病變狀況，記錄關節腫脹數和炎癥指數評分[7]。

1.7 病理學觀察d 28大鼠全部處死，對其踝關節和脾臟進行病理評價[9]。

2 結果

2.1 構建雄性和雌性大鼠AA模型大鼠在產生炎癥后的18 h，右后足爪出現腫脹高峰，3 d后炎癥反應下降，d 9后再次發生腫脹；繼發病變在致炎后d 14出現紅腫現象；d 21左右，前后肢腫脹(Fig 1A-C)，尾根部及鼻翼附近產生結節(Fig 1D-E)；在成模過程中，雄性和雌性大鼠關節出現腫脹、精力頹靡和活動受阻等，提示造模成功。

Fig 1 Secondary inflammation of rat AA(n=8)

2.2 雄性和雌性大鼠體質量的變化情況從d 14開始，模型組大鼠體質量隨炎癥的嚴重程度下降。模型組大鼠的體質量因炎癥的產生明顯低于正常組同性別的大鼠，d 21后處于平穩狀態。對模型組雄性和雌性大鼠的體質量比較發現，雌性大鼠的體質量明顯下降(Fig 2)。

Fig 2 Changes in body weight of male *P<0.05,**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats;#P<0.05,##P<0.01 male model group rats vs female model group rats

2.3 雄性和雌性大鼠足爪的腫脹狀況正常組和同性別模型組大鼠的足爪腫脹度比較結果顯示，d 14開始，模型大鼠足爪腫脹度明顯升高(Fig 3)，模型組雄性和雌性大鼠之間差異并未有顯著性。

Fig 3 Changes of paw swelling in male *P<0.05,**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats

2.4 雄性與雌性AA大鼠關節腫脹數、關節炎指數和全身評分的變化情況雄性、雌性模型組d 7開始關節腫脹數均明顯升高，d 21左右達高峰，d 24后關節腫脹數、關節炎指數與全身評分逐漸下降，雄性和雌性大鼠評分差異均無顯著性(Fig 4)。

Fig 4 Changes of joint swelling, arthritis index and systemic score in male and female AA rats A:Effect on joint swelling; B:Effect on arthritis index;C:Effect on arthritis global assessment

2.5 雄性和雌性大鼠踝關節病理評分變化情況病理切片顯示，在大鼠AA模型中關節滑膜細胞增生，有血管翳以及炎癥細胞大量浸潤(Fig 5A-D)。對踝關節進行病理觀察發現：模型組中雄性和雌性大鼠的滑膜細胞增殖情況變多，在骨侵蝕、炎癥細胞浸潤、血管翳及炎癥的嚴重程度較正常組嚴重且差異有顯著性(Fig 6A-E)。在對模型組雄性和雌性大鼠之間進行比較發現，在骨質侵蝕與炎癥方面雄性和雌性大鼠之間差異有顯著性且雌性大鼠的嚴重程度高于雄性大鼠(Fig 6B,E)。

Fig 5 Pathomicrographs of ankle joints in rats A: Normal male rats (♂); B: Female normal rats (♀); C: Male model rats (♂); D: Female model rats (♀).Arrow a: Synoviocytes hyperplasia; arrow b: Inflammatory cell infiltration; arrow c: Bone erosion

Fig 6 Changes of ankle joint pathological scores in male and female rats n=8)A: Synoviocytes hyperplasia; B: Bone erosion; C: Cell infiltration; D: Pannus; E: inflammation.**P<0.01 rats in normal group vs rats of the same gender model group;#P<0.05,##P<0.01 male model group rats vs female model group rats

2.6 雄性和雌性大鼠脾臟病理評分變化情況病理切片結果顯示，在大鼠AA模型中藍染的淋巴細胞聚集范圍擴大(Fig 7A-D)。對脾臟進行病理觀察發現，模型組大鼠的淋巴結出現增生現象，生發中心的數量變多且與正常組大鼠差異有顯著性(FIG 8A,C,E)。模型組中雄雌進行比較的結果顯示，雄性和雌性大鼠的動脈周圍淋巴鞘細胞的密度、邊緣區增生與生發中心數量差異有顯著性，雌性大鼠的炎癥程度較雄性大鼠嚴重(Fig 8A,C,E)。

Fig 7 Micrographs of spleen in rats n=8)A: Male normal group rats (♂); B: Female normal group rats (♀); C: Male model group rats (♂); D: Female model group rats (♀).Arrow a: Germinal center, arrow b: Marginal zone hyperplasia; arrow c: Red pulp hyperplasia; arrow d: Periarterial lymph sheath

Fig 8 Changes in spleen pathological scores in male and female n=8)A: Periarterial lymphatic sheath; B: Lymph node hyperplasia; C: Marginal zone hyperplasia; D: Red pulp hyperplasia; E: Germinal center.**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats;#P<0.05,##P<0.01 male rats in model group vs female rats in model group

3 討論

RA的發病機制可能與遺傳、生活方式等多因素有關。

研究疾病的機制需選用合適的動物模型，可模擬條件顯示出與人類疾病相似的狀態。大鼠AA模型與RA患者的疾病特征類似且具有發病快、模型制備方法簡單等優點，常作為研究RA病因或治療手段等的重要工具[10]。在RA疾病中存在性別差異，可能是女性對體液免疫有較強的反應與性激素共同影響的結果[6]，雌激素可雙向影響細胞免疫，當體內雌激素含量升高時(分娩前)患有RA的患者疾病癥狀減輕，當含量降低時(分娩后)，又呈現出原有的疾病癥狀[11]。細胞免疫與體液免疫反應對RA的發病有一定的影響[12-13]。

為探討在動物模型中是否因雌雄差異而引起疾病嚴重程度的不同，采用雌雄年齡、體質量相近的SD大鼠，經10 g·L-1的CFA誘導后構建AA模型，大鼠在產生炎癥后的18 h，足爪出現腫脹高峰，d 9左右再次發生腫脹；繼發病變在致炎后d 14左右出現紅腫現象；d 21左右達炎癥高峰，炎癥發生較為迅速；模型組雌性大鼠的體質量較雄性大鼠輕，可能與雌性大鼠對炎癥的反應強烈，食欲減退，抵抗力下降有關；在對關節與脾臟的一系列評分發現，雌性大鼠的炎癥嚴重程度較雄性大鼠深，且差異有顯著性，與RA女性患者發病率較男性高的研究結果相吻合。本實驗所構建的大鼠AA模型，雌性與雄性大鼠的疾病嚴重程度在臨床表現與病理方面存在差異，雌性大鼠更易于誘導模型。然而在大多數實驗中，研究者采用雄性大鼠，可能與排除性激素的干擾及雌性大鼠抵抗力低，死亡率較雄性大鼠高有關。期望本文能對研究RA雄性與雌性的大鼠選擇提供新的參考依據，從而更加全面地研究RA。