基于網絡藥理學和分子對接法探索麻杏甘石湯治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)活性化合物的研究

姜 山，時 爽，單萬亭，鞠愛霞，李秋紅

(黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

2019年末，一種新型冠狀病毒導致的肺炎在湖北武漢暴發，隨后蔓延至全國。此次發現的新型冠狀病毒為β屬與2003年發現的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus)和2012年發現的中東呼吸綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus)為同一種屬[1]，是繼HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV之后第七種已知的人類冠狀病毒。COVID-19的傳播能力強，途徑廣，可通過飛沫、接觸，以及密閉環境中可能通過氣溶膠傳播。人群普遍易感，輕癥患者多出現低熱、輕微乏力，無肺炎表現等癥狀；重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征，引起代謝紊亂、休克、器官衰竭甚至死亡。

國家衛健委指出，根據數據信息提示，總體上我國本輪疫情流行高峰已經過去。但是，在世界范圍內，COVID-19疫情仍十分嚴峻，多個國家相繼大范圍暴發，截至2020年3月10日24時，我國累計報告確診病例80 778例，境外確診病例已超3萬人，感染數量已經超過了2003年SARS的暴發[2]。目前，仍未發現治療COVID-19的特效藥，我國主要采用中西醫結合的治療方法，西醫主要使用α-干擾素、利巴韋林等開展診療，中醫則以清肺排毒湯等根據病情、各地氣候特點以及患者體質的不同辨證論治。

麻杏甘石湯出自張仲景所著的《傷寒論》中，方劑由15 g麻黃、15 g杏仁、10 g甘草、30 g石膏組成，本方主要是治療太陽病汗下后，邪氣內傳于肺，肺熱奎滯，氣逆而喘，具有辛涼疏表、清肺平喘的功效，可廣泛用于治療外感發熱、肺炎咳喘、支氣管哮喘、肺氣腫等疾病[3]。國家衛健委和國家中醫藥管理局聯合發布的中藥復方清肺排毒湯中也包含麻杏甘石湯，方中麻黃為主藥，能發汗宣肺；重用石膏為輔，可清瀉肺熱；杏仁宣利肺氣為佐，助麻黃以止咳平喘；甘草調和諸藥為使[4]。麻杏甘石湯在治療呼吸道疾病的同時又有抗炎、抗流感病毒、調節免疫功能的作用[5]。

網絡藥理學是基于系統生物學和生物信息學的理論，建立在高通量組學數據分析、計算機虛擬計算及網絡數據庫檢索基礎上實現新藥設計和藥物作用機制挖掘的學科。闡釋疾病的發生發展過程，從改善或恢復生物網絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發現。分子對接則是利用計算機模擬配體與受體蛋白結合，結合自由能表示結合能力的強弱，自由能越小表示配體和受體相互匹配作用越佳[6]。本研究預測麻杏甘石湯中的核心活性化合物，并對中藥-化合物-靶點進行分子對接和網絡藥理學分析，為新藥研發及治療COVID-19提供依據。

1 方法

1.1 麻杏甘石湯活性成分數據庫的構建基于TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/)獲取麻杏甘石湯中的成分信息，以“麻黃”“杏仁”“甘草”“石膏”為關鍵詞進行檢索，篩選條件OB≥30%，且DL≥0.18[7]的化學成分作為活性成分并收集相關靶標蛋白。

1.2 C-T網絡構建及PPI分析與麻杏甘石湯相關的所有靶標均從TCMSP數據庫中收集，隨后通過將類型限制為“人源”，在UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫中提取基因的正式名稱，借助Cytoscape3.7.1軟件建立C-T網絡，對網絡中的活性化合物和靶點初步分析。將活性化合物對應的靶點蛋白導入STRING平臺(https://string-db.org/)，獲取蛋白相互作用的關系。

1.3 生物學及通路富集分析麻杏甘石湯的作用靶點使用GO富集和KEGG通路分析，基于注釋、可視化等模塊在DAVID數據庫進行分析(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)。P<0.05提示富集具有統計學意義，且通路結果可能是麻杏甘石湯治療COVID-19的重要功能機制，得到的數據運用R軟件繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.4 分子對接分析分子對接的結合能為負表明配體與受體可以自發結合，研究選取結合能≤-5 kJ·mol-1的活性成分[8]作為麻杏甘石湯治療COVID-19靶點的篩選依據。選取SARS-CoV-2 3CL水解酶和 ACE2做為分子對接的靶蛋白，并借助PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)獲取3D結構，使用TCMSP數據庫下載化合物的3D結構保存為*mol2格式，TCMSP數據庫未找到的化合物用ChemOffice軟件構建化合物的3D結構并使其能量最小化作為分子對接配體。利用PyMOL軟件、Auto Dock軟件處理化合物及靶蛋白后用vina進行對接。

2 結果

2.1 活性成分及靶蛋白的篩選根據OB≥30%，DL≥0.18，篩選出化合物134個，其中23個來自麻黃，19個來自杏仁，92個來自甘草，石膏的化學成分并未在數據庫中檢索到，部分活性化合物基本信息見Tab 1。

Tab 1 Basic information of active compounds of Maxingganshi decoction

2.2 C-T網絡及拓撲分析中藥-化合物-靶點網絡總共包括345個節點和1936條邊，網絡中紅色菱形、藍色三角形、綠色橢圓形、黃色平行四邊形、紫色六邊形、青色八邊形分別代表麻黃、杏仁、甘草、麻黃和杏仁共有、麻黃和甘草共有、杏仁和甘草共有的化合物，深黃色長方形代表靶點(Fig 1)。通過分析化合物-靶點之間的中心度值、親中心度值以及等級值發現，排名在前6位的化合物分別是槲皮素、山奈酚、柚皮素、豆甾醇、木犀草素、甘草黃酮，分別能與274、104、64、54、51、42個靶點蛋白發生相互作用。靶點方面，排名前列的是PTGS2、ESR1、PPARG、AR、NOS2、NCOA2，分別能與108、84、75、74、72、65個化合物發生相互作用；從靶點相互作用的角度，排名靠前的是AKT1、MAPK3、IL6、VEGFA、JUN、CASP3、MAPK8，分別能與136、121、120、110、104、103、101個蛋白發生相互作用(Fig 2)。通過網絡分析發現，麻杏甘石湯中所含化合物在不同中藥中均存在，借助Venny 2.1在線平臺繪制韋恩圖(Fig 3)，分析發現MOL000098槲皮素、MOL000422山奈酚、MOL004328柚皮素為麻黃和甘草所共有；MOL000449豆甾醇、MOL000492(+)-兒茶素為麻黃和杏仁所共有；MOL002311甘醇、MOL000359谷甾醇、MOL004841甘草查耳酮B、MOL000211丁子香萜、MOL004908甘草黃酮、MOL004903甘草苷、MOL005017菜豆酚為杏仁和甘草所共有。

Fig 1 Chinese medicine herb-compound-target network of Maxingganshi decoction

Fig 2 Number of adjacent nodes at target

Fig 3 Distribution of compounds in Maxingganshi decoction

2.3 靶點富集分析DAVID中GO功能富集分析得到GO條目226個(P<0.05)，其中生物過程(biological process, BP)條目165個，細胞組成(cellular component, CC)條目24個，分子功能(molecular function, MF)條目37個，分別占73%、10.6%、16.4%(Fig 4)。KEGG通路富集篩選得到65條信號通路(P<0.05)，涉及PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、T細胞受體信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用等，見Tab 2和Fig 5。

Tab 2 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.4 分子對接結果分析一般認為配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性越大。分子對接結果顯示麻杏甘石湯中核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶有較好的結合活性，見Tab 3和Fig 6。

Tab 3 The binding affinities of core compounds of Maxingganshi decoction and clinical treatment drugs with SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

Fig 4 GO enrichment analysis of targets of Maxingganshi decoction

Fig 5 Analysis of KEGG enrichment in 20 pathways as targets of Maxingganshi decoction

Fig 6 Molecular docking of SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2 with glabridin and kaempferolA: glabridin-SARS-CoV-2 3CL hydrolase; B: kaempferol-SARS-CoV-2 3CL hydrolase; C: glabridin-ACE2; D: kaempferol-ACE2

3 討論

目前，根據各地病例信息和臨床療效的數據統計顯示，中醫藥對于COVID-19的治療起到了重要的作用，中醫學認為，“正氣存內，邪不可干”，在沒有特效藥的情況下，廣泛宣傳“治未病”的理念，未病先防，已病防變，提醒人們增強自身免疫力，共同抗擊疫情。國家衛健委已將新冠肺炎納入“疫病”的范疇，由感受疫癘之氣所致。新冠肺炎疫情具有強烈的傳染性和大面積流行的特征，屬于中醫上“瘟疫”的范疇。瘟疫是病毒通過口鼻侵入造成呼吸道感染而致病，導致肺部細胞受損，如若正氣不足免疫力低下則使病情加重，肺部細胞大量壞死，輕者發熱、咳嗽、咽痛、胸悶、氣促、喘息、乏力，重者肺部纖維化導致呼吸困難甚至衰竭，最終威脅生命[9]。中醫藥歷經數代疾病，面對COVID-19的治療也有足夠的經驗，并在此次疫情中起到了很好的治療作用和不可替代的地位，通過分析中醫治療的推薦處方，可以在現階段對COVID-19的臨床治療處方中，明顯的看出是通過麻杏甘石湯的基礎方劑上進行適當改變用藥的。

麻杏甘石湯中麻黃可宣肺散寒，杏仁能宣散肺氣，甘草用于調和諸藥，石膏有清熱之功效，此方為千古以來治療風溫肺熱病(肺炎)的主要方劑，針對表寒肺熱，可表里雙治。從網絡藥理學的分析中發現，將麻杏甘石湯中綜合評分最高的6個化合物同目前臨床治療應用的化學藥與SARS-CoV-2 3CL水解酶進行分子對接研究，這些關鍵化學成分具有接近甚至超越化學藥的結合能力，特別是甘草黃酮和山奈酚均低于利巴韋林、利托那韋等化學藥的結合能。根據文獻報道，SARS-CoV-2病毒是ACE2作為進入受體，通過受體介導的胞吞作用感染肺泡上皮細胞而引起肺炎[10]。故將方劑中關鍵化學成分及西藥與ACE2進行分子對接比較，結果顯示甘草黃酮的結合能為-28.42 kJ·mol-1，低于全部化學藥的結合能，其他關鍵化學成分的結合能也較化學藥相比有不同程度的降低。通過網絡藥理學和分子對接技術結果表明麻杏甘石湯對于治療COVID-19應該有較好的療效。

通過KEGG通路富集分析發現，結果大多涉及免疫系統、內分泌系統及與炎癥相關的通路，SARS-CoV-2病毒感染會引起劇烈的免疫及炎癥反應，并激活大量細胞因子，其中Th17細胞的主要功能是促進中性粒細胞的動員、募集和活化，介導促炎癥反應，一系列細胞因子如TGF-β、IL-6、IL-9、IL-1、IL-23、IL-21、IRF4、STAT3參與了Th17細胞分化過程[11]。IL-17是Th17細胞的關鍵效應因子，能夠引起多種細胞合成并分泌IL-6、IL-8等細胞因子，使ICAM-1的表達上調，從而導致炎癥的產生[12]。麻杏甘石湯的多靶標可能是通過調控免疫相關通路以及細胞炎癥因子作用相關通路，對免疫以及炎癥反應進行抑制。

據載，生石膏主要應用于外感熱病所致的肺熱咳喘，而且肺熱咳喘是COVID-19 的主要癥狀之一[13]。但其未收錄在TCMSP數據庫中，故未收集此藥物。而其主要成分硫酸鈣與SARS-CoV-2 3CL 水解酶進行分子對接，實驗結果并不理想，因此硫酸鈣未納入麻杏甘石湯治療 COVID-19 的核心活性化合物。

綜上所述，我們通過對麻杏甘石湯網絡藥理學分析預測，麻杏甘石湯的治療作用可能是通過活性物質對炎癥相關信號通路的調控機制有關，如PI3K/AKT通路。有必要對麻杏甘石湯進行進一步的驗證實驗研究，探討其關鍵作用機制。